один из наиболее чувствительных и надежных количественных методов анализа экспрессии генов. Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени.
ПЦР-исследования
Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации. Пациент, принимающий какие-либо лекарственные препараты или БАД, должен сообщить об этом врачу: возможно придется остановить курс приема, так как действующие вещества средства могут исказить результаты лабораторного анализа. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение. Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют.
Значит, заболевание находится на очень ранней стадии развития. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь раннем этапе, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить. ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна: она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК[12]. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.
Новые и альтернативные методы диагностики ВИЧ Недавно, сотрудниками Питтсбургского университета был разработан новый высокочувствительный тест для обнаружения скрытых вирусов — тест TZA. Для его проведения требуется меньше времени и крови пациента. Принцип действия TZA сводится к поиску гена, который активируется только при репликации вируса. Несмотря на то, что разработчики уверены в эффективности теста, большинство специалистов склоняется к тому, что TZA не сможет заменить существующие методы диагностики полностью, поскольку он характеризуется иным механизмом действия и не подходит абсолютно каждому ВИЧ-инфицированному пациенту. При желании пациента, кровь на анализ можно сдать анонимно и абсолютно бесплатно.
Сделать это можно в медицинских организациях по месту жительства, в Свердловском областном центре профилактике и борьбы со СПИД г. Екатеринбург, ул. Ясная, 46. Диагностика ВИЧ — дело сугубо добровольное. Однако есть четыре ситуации, для которых прохождение теста является обязательным: Донорство.
Трудоустройство на работу, предполагающую непосредственный контакт с биоматериалом, который может содержать ВИЧ. Иностранные граждане. Лица при призыве на военную службу, поступающие в военные учебные заведения. Но и в этих случаях тестирование не может проводиться насильно, поскольку для любого медицинского вмешательства необходимо добровольное и осознанное согласие пациента.
Разберем ПЦР анализ: что это такое и как выполняют это исследование. ПЦР анализ: что это такое? ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей.
В них происходит анализ на предмет присутствия возбудителей инфекционных, паразитарных или вирусных заболеваний. Суть ПЦР состоит в многократном «клонировании» находящихся в исследуемом материале фрагментов ДНК инфекционного агента. ПЦР диагностика инфекций считается наиболее быстрым, современным методом. ПЦР диагностику используют повсеместно. Все ведущие клиники используют диагностику ПЦР для верификации инфекционных заболеваний. Часто пациенты спрашивают, какие именно заболевания можно выявить при помощи метода ПЦР диагностики? Диагностика методом ПЦР используется для выявления широкого спектра возбудителей.
Как делают ПЦР анализ? Такое исследование проводится одинаково для диагностики любого заболевания.
Потому методика представляет такую ценность для диагностики наследственных аномалий. Способ не до конца освоен, потому считается перспективным.
Как уже было сказано, с помощью методики можно установить отцовство. Используется отдельная модификация анализа. Подготовка к исследованию Меры зависят от того, какой биоматериал будут брать. Вот некоторые варианты: Моча Изучение урины требуется, когда проводят диагностику мочеполовых инфекций, поражений венерического плана у мужчин и женщин.
У первых методика применяется не всегда. Часто ее заменяют забором соскоба из уретры. Перед проведением обследования, накануне запрещена гигиена репродуктивных органов. Анализ сдают в течение суток с момента подозрительного полового акта.
Но это не строгое требование, а скорее рекомендация по раннему выявлению патологического процесса. Кровь Также ее отдельные компоненты: сыворотка и пр. Забирают для определения гепатитов разных форм, дифференциальной диагностики патологий печени, выявления герпеса, СПИДа, также при обследовании на предмет генетических аномалий. Особых правил подготовки в этом случае нет.
Кровь сдают натощак, это единственное требование к пациенту. Мокрота Отделяемое слизистой оболочки дыхательных путей. Исследуется для диагностики респираторных патологий, пневмонии, бронхита, определения источника процесса. Также в рамках выявления других поражений: будь то легочные формы микоплазмоза или прочие.
Специальная подготовка не требуется. Биоптат Биологический материал слизистой оболочки пищевода и желудка. Используется для диагностики причин язвы, гастрита и прочих патологий этой области. Например, таким способом удается надежно обнаружить хеликобактер, который чаще всего и оказывается виновником патологических процессов.
Подготовки опять же не нужно. Соскобы со слизистых оболочек Используются особенно часто. В основном, в рамках выявления венерических заболеваний, коронавируса. Но не только.
Достаточно временно ограничить гигиену половых органов или полости рта, чтобы не смыть следы патогенной флоры, вирусов. Другие биологические жидкости Будь то ликвор, секрет предстательной железы и прочие. По показаниям. Подготовка будет специфической.
Вопрос стоит уточнить у лечащего врача. Основном требование подготовки к анализу ПЦР и его проведению — это забор биоматериала в стерильную посуду. Кроме того, образец не должен контактировать с окружающей средой и руками медицинского персонала. Как показывает практика, больше половины случаев неверного результата обусловлена именно нарушениями технологии получения биоматериала.
Потому для ПЦР-анализа используются одноразовые колбы, пробирки, вакуумные системы забора крови, которые обеспечивают полную стерильность условий обследования.
Преимущества обращения в нашу клинику
- Принцип метода ПЦР (полимеразная цепная рекация), часть 1 (д.б.н. Ю.М. Романова) - YouTube
- В Роспотребнадзоре объяснили, чем отличается экспресс-тест на COVID-19 от ПЦР
- А как обнаружить скрытые инфекции у мужчин и женщин?
- ПЦР анализ: что это такое?
- Мутации врозь: ПЦР-тесты научились отличать «Омикрон» от «Дельты» | Статьи | Известия
- ПЦР в режиме реального времени – новейшие технологии в диагностике инфекций
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. Характеристика метода ПЦР. Исследование при помощи полимеразной цепной реакции относится к количественным анализам. Диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) показывает наличие половых инфекций с очень большой точностью. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных результатов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяйствах. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале.
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
ПЦР в режиме реального времени — новейшие технологии в диагностике инфекций Опубликовано 9 Май 2009 пользователем egorushkin ДНК-диагностика- это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека. ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР полимеразной цепной реакции. ПЦР-диагностика - это метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, в частности, этот метод широко применяется и для диагностики ИППП- инфекций, передающихся половым путем. Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач. Для ПЦР-диагностики инфекций достаточно небольшого фрагмента, поскольку любая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований. При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма.
Этот принцип и был положен в основу реализации метода полимеразной цепной реакции, сущность которой заключается в многократном преумножении микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. При этом наблюдается копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует специалиста на данный момент. Цикл образования новой молекулы ДНК занимает порядка трех минут, при этом 30—40 циклов оказывается вполне достаточно для получения должного количества молекул, необходимого для достоверного визуального определения искомого агента методом электрофореза. Литература: 1. Высотин С. Гильмиярова Ф. Полимеразная цепная реакция. История открытия. Лопухов Л. Нестеров С. Современное состояние и перспективы. Орадова А. Разумовская И. Нанотехнология: учеб. Элективный курс. Ребриков Д.
Эта методика позволяет не только выявить ДНК возбудителя туберкулеза, но и те его мутации, которые указывают на устойчивость к препаратам противотуберкулезного ряда. Одним из передовых методов ПЦР является метод гибридизации на стрипах, который позволяет провести определение микобактерий и их устойчивость к противотуберкулезным препаратам". Актуальность проведения ПЦР-исследования на туберкулез прежде всего в том, что данная методика позволяет выявлять микобактерии у пациентов без бактериовыделения. Благодаря данной методике диагностировать туберкулез и назначать правильные схемы лечения учитывая устойчивость к определенным препаратам стало значительно легче.
В таком случае любые заключения являются субъективными и зависят от квалификации специалистов, выполняющих диагностику. Кроме того, некорректно сравнивать FISH-тест с другими видами генетической диагностики - часто FISH имеет специфическое применение в качестве единственного возможного метода диагностики, например, при таких заболеваниях, как миелолейкоз, лейкоз, хронический лимфолейкоз и др. NGS секвенирование нового поколения Позволяет рассмотреть все мутации в заданном списке генов в рамках одного исследования исследование панели генов , давая полную картину имеющихся мутаций, что позволяет избежать дополнительного тестирования. Значительный объем данных, получаемых при выполнении секвенирования генома, обуславливает продолжительность выполнения NGS-секвенирования генома. Например, изучение панели наиболее распространенных генов, мутации в которых имеют клиническую значимость в онкологии примерно 30 генов , методом NGS выполняется в срок 20-30 рабочих дней. Технологические возможности секвенаторов, работающих в лаборатории МИБС, позволяют говорить о резерве снижения срока выполнения тестирования по мере роста спроса на профессиональную генетическую диагностику со стороны российских онкологов из других регионов. С конца 2021 года МИБС предлагает удобную схему логистики образцов тканей опухолей и образцов крови для выполнения NGS-исследований, что открывает доступ к высокотехнологичной диагностике онкологу из любого региона, тем самым повышая качество лечения онкологических заболеваний на уровне государства. Для выбора наиболее оптимальной схемы лечения с включением в ее состав иммунотерапии либо таргетной терапии, клинические онкологи лечебных центров, входящих в структуру МИБС Онкологическая клиника МИБС, Центр протонной терапии МИБС используют данные NGS, полученные в собственной молекулярно-генетической лаборатории ПЦР полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция - это хорошо знакомый, точный и востребованный метод определения мутаций в указанных генах. С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. В таком случае невысокая стоимость и небольшой срок выполнения исследования, являющиеся преимуществом ПЦР при решении точечных диагностических задач при необходимости всестороннего изучения генов у онкологических пациентов не перекрывают определенных ограничений, которые присущи ПЦР. В первую очередь, это недостаточная информативность - один ПЦР-анализ позволяет проверить мутацию в одном конкретном гене, которую может предположить врач-онколог. В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами: ПЦР исследование - позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов к.
Все под контролем! Правильный способ использования внутреннего контрольного образца (ВКО)
При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. Характеристика метода ПЦР. Исследование при помощи полимеразной цепной реакции относится к количественным анализам. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это прямой метод выявления возбудителя, то есть с помощью него можно определить РНК вируса со слизистой ротоглотки или носоглотки, то есть можно определить сам коронавирус.
ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится?
Метод стал настолько популярен, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК. Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 пар нуклеотидов п. Это в свою очередь способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки возможных применений метода. Появление метода ПЦР было обусловлено определенными достижениями в области молекулярной генетики, прежде всего расшифровкой нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. Следует отметить, что этому открытию сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК олигонуклеотиды. В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом молекулярной биологии, молекулярной генетики и клинической лабораторной диагностики, позволяющим выявлять в тканях и биологических жидкостях организма единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний.
Специфичность метода определяется уникальностью генетического материала выявляемых инфекционных агентов, к которому подобраны олигонуклеотидные праймеры, участвующие в процессе амплификации. Диагностика инфекционных заболеваний, в том числе вызванных трудно культивируемыми агентами, генотипирование микроорганизмов, оценка их вирулентности, определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, пренатальная диагностика, биологический контроль препаратов крови - вот неполный перечень направлений медицины с применением ПЦР. На сегодняшний день ПЦР-анализ остается наиболее распространенной и динамично развивающейся технологией. Ежегодно на рынке появляются десятки новых тест-систем для ПЦР-анализа, предназначенных как для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов - возбудителей заболеваний, так и для исследования генов человека. Себестоимость ПЦР-анализа неуклонно снижается, что способствует все более широкому использованию метода в лечебных и диагностических учреждениях. Количество ПЦР-лабораторий в странах СНГ растет в геометрической прогрессии и, видимо, в ближайшее время ПЦР-анализ станет одним из самых распространенных методов лабораторной диагностики. Суть метода заключается в многократном копировании амплификации в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ. Эта реакция носит название репликации ДНК.
Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, то есть осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. Создание программируемых термостатов амплификаторов , которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для их идентификации. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки 20 нуклеотидных пар , называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Амплификация специфических фрагментов ДНК;. Детекция продуктов амплификации. Выделение ДНК РНК На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации.
Амплификация специфических фрагментов ДНК На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Ее пять штрих-концов фиксируются ферментом ДНК-полимеразой, что обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплиментарной первой. То же самое, только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, однако, поскольку расплетение молекулы ДНК идет в обратном порядке, новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются. Для того чтобы фермент ДНК-полимераза начал свою работу, требуется наличие затравки или праймера - небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который, соединяясь с комплиментарным участком одной из цепей родительской ДНК, образует стартовый блок для наращивания дочерней нити. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная температура отжига праймеров - одна из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплиментарным последовательностям. Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера.
Фактически праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Такие фрагменты ДНК называются ампликонами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого. Время отжига -20-60 сек. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой олигонуклеотиды длиной около 20 п. Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дезоксирибонуклеотидфосфат. Этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой.
Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК ампликона и т.
Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё Рис. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца. Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено. Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.
Выделение на магнитных частицах Рис. Схема протокола выделения на магнитных частицах. Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 3. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др. К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют Рис. Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование например, центрифуга. Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике.
Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца. Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие. Умное выделение Smart Extraction Рис. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena. Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry. Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор.
При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества Рис. Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот. Ферментативное температурно-зависимое выделение Рис. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца.
Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку. Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами. Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов. Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения от 7 минут и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов. Разрезание и сшивание ДНК Рестрикция и рестриктазы Разрезание ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах.
Этот метод был изобретен при изучении в 1950—1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой. Оказалось, что они для этого используют ферменты, позднее названные рестрикционными нуклеазами или рестриктазами. Важным свойством каждого подобного фермента является его способность разрезать строго определенную - целевую - последовательность нуклеотидов ДНК. Рестриктазы не воздействуют на собственную ДНК клетки, поскольку нуклеотиды в целевых последовательностях модифицированы так что, рестриктаза не может с ними работать Правда, иногда, наоборот, они могут разрезать только модифицированные последовательности - для борьбы с теми, кто модифицирует ДНК, защищаясь от вышеописанных рестриктаз. Из-за того, что целевые последовательности бывают различной длины, частота встречаемости их в молекулах ДНК варьирует чем: длиннее необходимый фрагмент, тем меньше вероятность его появления. Соответственно, образующиеся при обработке различными рестриктазами фрагменты ДНК будут иметь различную длину. Рисунок слева. Сайты рестрикции. Сверху — целевая последовательность рестриктазы SmaI, при работе которой образуются «тупые» концы.
Снизу — целевая последовательность рестриктазы EcoRI, при работе которой образуются «липкие» концы. Итак, рестриктазы — это группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических и некоторых других организмах и выполняющие тем самым «иммунную» функцию — системы рестрикции-модификации. Для исследований их выделяют преимущественно из прокариотических клеток. Данные ферменты, «узнающие» определенные последовательности сайты рестрикции в двухцепочечной ДНК, расщепляют нуклеиновые кислоты в середине молекулы. Рестриктазы этого типа - узнают палиндромальные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты. Также рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид последовательность из 4-х пар оснований и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Рестрикционный анализ ДНК Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем.
Основные переменные параметры — это температура инкубации и состав буфера. К температурному режиму предъявляются достаточно жесткие требования, тогда как различия между буферами чаще всего лишь незначительны. Рестрикционный анализ ДНК широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК. При помощи эндонуклеаз рестрикции можно исследовать ДНК различных вирусов, бактерий, животных, растений. Как правило, продукты расщепления ДНК анализируются с помощью гель-электрофореза в агарозном или акриламидном геле, а полученная таким образом картина разделения фрагментов ДНК в виде определенного, отличающегося для разных ферментов, набора полос и является результатом рестрикционного анализа той или иной ДНК. Короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При сравнительно высокой концентрации агарозы большие фрагменты вообще не могут проникнуть в гель. В процессе миграции рестрикционные фрагменты не деградируют, их можно вымывать в виде биологически активных двухцепочечных молекул. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает рестрикционному фрагменту, молекулярную массу которого можно определить, проведя калибровку с помощью ДНК с известными молекулярными массами подробнее см.
При использовании нескольких эндонуклеаз рестрикции на одном образце можно составлять рестрикционные карты. Располагая такой информацией, можно идентифицировать на ДНК биологически важные участки. Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет оценить гомологию между ними. Анализируя рестрикционные карты, можно сравнивать определенные участки ДНК разных видов животных без определения их нуклеотидной последовательности. Таким образом, например, было установлено, что хромосомные участки, кодирующие цепи гемоглобина у человека, орангутанга и шимпанзе сохранились в практически неизменном виде в течение последних 5 - 10 млн. Метод рестрикционного картирования позволяет увидеть крупные генетические изменения, такие как делеции или инсерции. При этом происходит уменьшение или увеличение рестрикционных фрагментов, а также исчезновение или возникновение сайтов рестрикции. Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК. Рекомбинантный фермент выделен из штамма кишечной палочки E.
Для улучшения результатов лигирования, общая рекомендация заключается в создании нескольких реакций с различными вставками: вектор молярных соотношений, как правило, в диапазоне от 1:1 до 5:1. Для менее эффективных лигирований, как и для фрагментов ДНК с тупыми концами, часто рекомендуется добавление инертных макромолекул, таких как полиэтиленгликоль ПЭГ , чтобы увеличить эффективную концентрацию компонентов реакции и тем самым повысить эффективность лигирования. Разделение молекул ДНК и белков Метод гель-электрофореза Электрофорез - это движение дисперсных частиц относительно жидкости под действием пространственно однородного электрического поля. Часто приходится иметь дело со смесью молекул ДНК разной длины. Например, при обработке химически выделенной из организма ДНК рестриктазами как раз получится смесь фрагментов ДНК, причем их длины будут различаться. Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза. ДНК помещают в гель обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением , который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду аноду , причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины.
С помощью маркеров смесей фрагментов ДНК известных длин можно установить длину молекул в образце Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, то есть сформируется электрическое поле. Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая гидрофильная пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции.
Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул.
Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.
Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы имеет огромное значение для эффективного лечения и предотвращения распространения инфекции. Принцип действия ПЦР состоит в многократном синтезе копий генетического материала вирусов или бактерий в лабораторных условиях. Для понимания этого явления напомним, что основой хранения наследственной информации и основой жизни является ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота.
ДНК состоит из двух нитей, которые сформированы из азотистых оснований — нуклеотидов. Нуклеотидов всего четыре. Нуклеотиды обладают свойством комплиментарности, то есть с определенным типом нуклеотида может связаться только определенный тип другого нуклеотида.
Например известны нуклеотиды аденин, тимидин, цитозин и гуанин. Из них аденин может связываться с тимидином, а цитозин с гуанином. Но не наоборот.
В последовательности нуклеотидов закодирована уникальная для каждого живого организма информация. Будь то человек или вирус. У некоторых вирусов наследственная информация закодирована в другой нуклеиновой кислоте —РНК.
Поэтому, идентифицировав ДНК, можно с уверенностью утверждать, что она принадлежит определенному микроорганизму. Упрощенно такой механизм идентификации можно сравнить с отпечатками пальцев. Рисунок линий на пальцах уникален для каждого человека.
Нет необходимости видеть портрет. Достаточно просто сверить отпечаток пальца с базой данных. Таким же образом работает и ПЦР.
Для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость. Подготовка к исследованию Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала[10]. Кровь сдается натощак утром. Мочу также следует собрать утром в стерильный контейнер и сдать в лабораторию в ближайшие два часа. Перед взятием мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации. Пациент, принимающий какие-либо лекарственные препараты или БАД, должен сообщить об этом врачу: возможно придется остановить курс приема, так как действующие вещества средства могут исказить результаты лабораторного анализа.
Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение. Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют.
Актуальные методы диагностики COVID-19
В России метод полимеразной цепной реакции был внедрен и начал использоваться в 1995 г. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных результатов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяйствах. 40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост. В середине 1990-х с помощью метода ПЦР-амплификации ДНК исследовали останки царской семьи Романовых.
Актуальные методы диагностики COVID-19
По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. ПЦР называют прямым методом, поскольку он выявляет возбудителя, а не иммунную реакцию организма, и является подтверждающим методом в диагностике инфекционных заболеваний. Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. один из наиболее чувствительных и надежных количественных методов анализа экспрессии генов.
ПЦР-диагностика
В это время многие ИППП или латентные инфекции могут быть крайне опасными для малыша и вызвать преждевременные роды, выкидыш, пороки и аномалии развития. Поэтому анализ ПЦР проводят всем беременным в плановом порядке преимущественно на ранних сроках до 12 недель , но иногда назначают и во время 2 триместра. Материал берут из канала шейки матки и уретры, процедура безболезненная и не представляет угрозы. Именно эти микроорганизмы представляют угрозу во время беременности. Но иногда женщины проходят комплексный анализ ПЦР, который включается в себя исследование на большое количество микроорганизмов 12 и более.
Кроме того, некорректно сравнивать FISH-тест с другими видами генетической диагностики - часто FISH имеет специфическое применение в качестве единственного возможного метода диагностики, например, при таких заболеваниях, как миелолейкоз, лейкоз, хронический лимфолейкоз и др.
NGS секвенирование нового поколения Позволяет рассмотреть все мутации в заданном списке генов в рамках одного исследования исследование панели генов , давая полную картину имеющихся мутаций, что позволяет избежать дополнительного тестирования. Значительный объем данных, получаемых при выполнении секвенирования генома, обуславливает продолжительность выполнения NGS-секвенирования генома. Например, изучение панели наиболее распространенных генов, мутации в которых имеют клиническую значимость в онкологии примерно 30 генов , методом NGS выполняется в срок 20-30 рабочих дней. Технологические возможности секвенаторов, работающих в лаборатории МИБС, позволяют говорить о резерве снижения срока выполнения тестирования по мере роста спроса на профессиональную генетическую диагностику со стороны российских онкологов из других регионов. С конца 2021 года МИБС предлагает удобную схему логистики образцов тканей опухолей и образцов крови для выполнения NGS-исследований, что открывает доступ к высокотехнологичной диагностике онкологу из любого региона, тем самым повышая качество лечения онкологических заболеваний на уровне государства. Для выбора наиболее оптимальной схемы лечения с включением в ее состав иммунотерапии либо таргетной терапии, клинические онкологи лечебных центров, входящих в структуру МИБС Онкологическая клиника МИБС, Центр протонной терапии МИБС используют данные NGS, полученные в собственной молекулярно-генетической лаборатории ПЦР полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция - это хорошо знакомый, точный и востребованный метод определения мутаций в указанных генах.
С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. В таком случае невысокая стоимость и небольшой срок выполнения исследования, являющиеся преимуществом ПЦР при решении точечных диагностических задач при необходимости всестороннего изучения генов у онкологических пациентов не перекрывают определенных ограничений, которые присущи ПЦР. В первую очередь, это недостаточная информативность - один ПЦР-анализ позволяет проверить мутацию в одном конкретном гене, которую может предположить врач-онколог. В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами: ПЦР исследование - позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов к.
Гордиев М.
В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. Процесс этот называется транскрипцией. Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.
Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый A , содержащий аденин, гуаниновый G - гуанин, цитозиновый C - цитозин, тиминовый Т - тимин, урациловый U - урацил. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания. Праймер — котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. Литература Глик Б. Молекулярная биотехнология.
Принципы и применение. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. Искусственные генетические системы — М. Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения.
Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент — уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны. Диагностика латентных инфекций.
ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания. Какие есть недостатки Единственный серьезный недостаток, связанный с методом полимеразной цепной реакции, - его высокая технологичность. Исследования ПЦР требуют строжайших соблюдений правил и серьезной оснащенности лабораторного комплекса. Не каждая лаборатория может позволить себе все необходимое оборудование. Урогинекология диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы. Важное значение для женского и мужского здоровья играет ВПЧ — вирус папилломы человека. Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе. Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции.
Респираторные заболевания.
ПЦР-диагностика
В Роспотребнадзоре разъяснили, чем отличается тестирование на коронавирус методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) от экспресс-теста. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК. Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе). По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке.