Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды. 6) автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа Метод ПЦР в реальном времени основан на детектировании сигнала флуоресценции, позволяющем наблюдать процесс накопления продукта в процессе реакции. Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. Отличия ПЦР-диагностики от других методов лабораторного исследования заключаются в следующем.
Что такое анализ ПЦР?
один из наиболее чувствительных и надежных количественных методов анализа экспрессии генов. По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки. Подчеркнем, что это исследование не направлено на выявление COVID-19 и не заменяет ПЦР-тест. диагностика) считается одним из самых современных и точных методов молекулярной диагностики различных инфекций, в том числе урологических и гинекологических заболеваний.
ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – современный метод исследования, основанный на увеличении малых концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. Согласно внесенным изменениям в санитарные правила, при контакте с зараженным коронавирусной инфекцией тест на COVID-19 методом ПЦР следует делать только при появлении симптомов. ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе.
Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?
- ПЦР - что это такое простыми словами, преимущества ПЦР анализов
- Секвенирование нуклеиновых кислот
- Анализ методом ПЦР. Что такое ПЦР-диагностика и для чего она используется
- Что такое ПЦР анализ
- ПЦР анализ – что это такое, как делают ПЦР анализ крови.
Достоверность метода ПЦР
Совсем недавно ПЦР использовали как последнюю надежду, когда с помощью других диагностических процедур подтвердить или исключить диагноз не получалось — методам не хватало чувствительности. Сейчас ПЦР-диагностику освоили во многих крупных лабораториях и продвигают её в качестве коммерческого метода, доступного каждому, кто хочет обследоваться. Обычно предлагают готовые наборы анализов: ПЦР на 3-5-7-14-16 и другое количество инфекций, передающихся половым путем. Нередко анализ навязывают тогда, когда обследоваться совсем не обязательно или можно обойтись более дешевой диагностикой без потери качества.
Давайте разберемся, когда нужно искать половые инфекции и когда это необходимо делать именно методом ПЦР. Обследоваться на ЗППП можно хоть каждый день — по желанию. Все зависит от наличия свободного времени, денег и уровня вашей тревожности.
Есть только один нюанс. Метод ПЦР — очень точный анализ. С его помощью можно обнаружить в недрах организма считанные копии вируса или бактерии.
И ни один честный врач не скажет вам наверняка, насколько эта находка опасна для здоровья, и каков достоверный риск осложнений. Поэтому решите для себя заранее, сможете ли вы спокойно жить дальше или будете лечить результаты анализа даже в тех случаях, когда до похода в клинику у вас не было никаких проблем с интимным здоровьем. Иначе обстоят дела с обследованием на ЗППП в группе риска — у людей с рискованным сексуальным поведением и беременных женщин.
Им необходимо периодически сдавать анализы на половые инфекции, даже если нет никаких жалоб на здоровье. Сексуальным экстремалам профилактическое обследование нужно, чтобы выявить факт инфицирования еще до появления симптомов и как можно раньше принять меры для защиты своих половых партнеров от заражения. Беременным женщинам диагностика ЗППП необходима, потому что многие мамины инфекции передаются будущему малышу.
Даже если нет симптомов у женщины, последствия для ребенка могут быть тяжелыми. Согласно принятым государственным программам как в нашей стране , так и в США , профилактическая диагностика скрининг на ЗППП проводится только среди людей с рискованным сексуальным поведением и у беременных женщин. Скрининг на герпес и ВПЧ не проводят даже в группе риска.
Для остальных людей при отсутствии жалоб и клинических проявлений обследование на ЗППП вообще не рекомендуется. Забор материала — дело нескольких минут.
Затем, используя последовательность между праймерами как шаблон, с помощью ДНК-полимеразы синтезируются две новые нити ДНК. Вновь синтезированные комплементарные нити ДНК формируют следующую копию исходной целевой последовательности. Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту 2, 4, 8,16, 32,... В результате количество копий участка ДНК между праймерами будет увеличиваться до тех пор, пока не израсходуются субстраты реакции праймеры и нуклеотиды. При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут.
Таким образом, в течение нескольких часов могут быть получены миллиарды копий стартовой молекулы ДНК. ПЦР может генерировать достаточные для анализа мутаций количества специфических генов из образцов ДНК.
Для понимания этого явления напомним, что основой хранения наследственной информации и основой жизни является ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота. ДНК состоит из двух нитей, которые сформированы из азотистых оснований — нуклеотидов. Нуклеотидов всего четыре. Нуклеотиды обладают свойством комплиментарности, то есть с определенным типом нуклеотида может связаться только определенный тип другого нуклеотида. Например известны нуклеотиды аденин, тимидин, цитозин и гуанин. Из них аденин может связываться с тимидином, а цитозин с гуанином.
Но не наоборот. В последовательности нуклеотидов закодирована уникальная для каждого живого организма информация. Будь то человек или вирус. У некоторых вирусов наследственная информация закодирована в другой нуклеиновой кислоте —РНК. Поэтому, идентифицировав ДНК, можно с уверенностью утверждать, что она принадлежит определенному микроорганизму. Упрощенно такой механизм идентификации можно сравнить с отпечатками пальцев. Рисунок линий на пальцах уникален для каждого человека. Нет необходимости видеть портрет.
Достаточно просто сверить отпечаток пальца с базой данных. Таким же образом работает и ПЦР. Выделив ДНК возбудителя от больного, можно совершенно четко его идентифицировать. При этом даже не важно, живой возбудитель или уже нежизнеспособный. Метод ПЦР с одинаковым успехом, в отличие от бактериологического посева, может идентифицировать присутствие возбудителя.
В случае отсутствия ДНК-мишени продукт не образуется. Иногда для удобства детекции или контроля эффективности в состав реакционной смеси могут быть внесены дополнительные компоненты. Внутренние контроли — несвойственный данному организму фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Практически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке. ДНК-зонды — искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера около 30 нуклеотидов , комплементарные специфическим ампликонам продуктам реакции. Могут использоваться для детекции продуктов ПЦР, благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам. Эти компоненты способны понижать температуру денатурации матрицы или стабилизируют ДНК-полимеразу. Если в пробе имеется искомая ДНК, с ней происходит ряд последовательных цикличных реакций, которые различаются температурными режимами. Ход реакции Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1]. Денатурация — процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур. Отжиг — процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются. Элонгация синтез. Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются: ПЦР с «горячим» стартом hot-start PCR — суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров. ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа. ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» End-point PCR — эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени. Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Мультиплексная мультипраймерная ПЦР — амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т. Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования. Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов. Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации. Все приборы должны соответствовать нормам безопасности.
ПЦР-диагностика
Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту 2, 4, 8,16, 32,... В результате количество копий участка ДНК между праймерами будет увеличиваться до тех пор, пока не израсходуются субстраты реакции праймеры и нуклеотиды. При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут. Таким образом, в течение нескольких часов могут быть получены миллиарды копий стартовой молекулы ДНК. ПЦР может генерировать достаточные для анализа мутаций количества специфических генов из образцов ДНК.
Конкретные части генов обычно экзоны быстро амплифицируются с помощью специфичных праймеров. Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации.
Новая разработка будет использоваться как лабораторная методика и не будет проходить регистрацию как коммерческое медицинское изделие, сообщают разработчики. Сравнение идет сразу по шести мутациям патогена. В организации отметили повышенную скорость его распространения, более высокий риск тяжелого течения заболевания и пониженную восприимчивость к антителам. Поэтому понимать, каким именно штаммом заражены больные, важно для улучшения мониторинга распространения новой версии коронавируса. Тест включает в себя праймеры и зонды — короткие фрагменты одноцепочечной ДНК. Они подобраны таким образом, чтобы взаимодействовать в пробирке с генетическим материалом коронавируса только при условии полного совпадения последовательностей. Каждая пара праймеров и зонда несет в себе либо мутацию геноварианта «Дельта», либо мутацию «Омикрона».
Если система срабатывает, значит, в генетическом материале эта конкретная мутация есть. Основу процесса исследования составляет метод ПЦР в реальном времени, который зарекомендовал себя как очень быстрый и чувствительный способ, подчеркивают в Роспотребнадзоре.
Данная «затравка» определена для каждого гена гена хламидии , микоплазмы , вирусов экспериментально. Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК — то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую - происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК. И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем». В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи.
Этапы проведения ПЦР исследования Забор биологического материала для исследования В качестве пробы служит различный биологический материал: кровь и ее компоненты, моча, слюна, отделяемое слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, отделяемое раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Все биопробы собираются одноразовыми инструментами, а набранный материал заключают в пластиковые стерильные пробирки или помещают на культуральные среды, с последующей транспортировкой в лабораторию. В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат — термоциклер амплификатор. В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов денатурация, отжиг и удлинение. Что это означает?
ПЦР — ферментативное «умножение» или амплификация фрагмента ДНК, расположенного между двумя олигонуклеотидами, так называемыми праймерами. Праймеры разрабатывают таким образом, что первый комплементарен одной нити молекулы ДНК с одной стороны целевой последовательности, а второй — другой нити противоположной стороны этой же последовательности. Затем, используя последовательность между праймерами как шаблон, с помощью ДНК-полимеразы синтезируются две новые нити ДНК. Вновь синтезированные комплементарные нити ДНК формируют следующую копию исходной целевой последовательности. Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту 2, 4, 8,16, 32,... В результате количество копий участка ДНК между праймерами будет увеличиваться до тех пор, пока не израсходуются субстраты реакции праймеры и нуклеотиды. При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут.
Диагностика ВИЧ: методы и исследования
40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост. Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл. Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА.
ПЦР-диагностика
Анна П. Всем советую сюда обращаться, по крайней мере на УЗИ по беременности. Со второй беременностью также обращалась сюда, уже в 2021. Персонал отличный! Когда делают УЗИ тебе все видно на экране телевизора. По ходу исследования все рассказывают и дают фотографию малыша. Яна Гудина У Регины Рубеновны проходила комплексное обследование.
И знаете, впервые для меня поход к гинекологу не был проблематичным. Все аккуратно, тактично, по человечески. Осталась очень довольна и уровнем и ценой. Большое спасибо! Алексей Л. Спасибо Роману Александровичу Гусейнову за помощь и понимание!
Отличный врач, профессионал своего. С большим желанием помогает, и всячески поддерживает.
Это современная методика лабораторного исследования, которая получила широкое распространение в клинической практике. В первую очередь она используется для диагностики различных инфекционных заболеваний. В связи с широкой распространенностью данной диагностической методики, у пациентов часто возникает вопрос: ПЦР анализ — что это такое? Цена анализа относительно не высокая, несмотря на то, что процедура позволяет получить достоверный результат.
Анализ крови ПЦР — что это такое?
Это один из основных методов обнаружения бактерий или вирусов на молекулярном уровне, с более высокой степенью точности, чем микроскопические или бактериологические исследования, и значительно более быстрый, чем метод культивирования. Это также единственный способ определить наличие генетических вариаций, указывающих на предрасположенность к онкологическим и другим заболеваниям. Чувствительность диагностических инструментов для выявления мутаций онкогенов и генов подавления опухоли была улучшена по крайней мере в десять тысяч раз благодаря ПЦР, что позволяет раньше диагностировать, например, такие виды рака, как лейкемия. Метод ПЦР также позволил разработать индивидуальную терапию для больных раком. Кроме того, ПЦР может использоваться для типирования тканей, которое имеет жизненно важное значение для имплантации органов. Образцы берут либо с помощью амниоцентеза либо с помощью биопсии ворсин хориона. В отличие от многих других тестов, ПЦР тест способен обнаружить признаки заболевания на самых ранних стадиях инфицирования, так как для выделения искомого ДНК или РНК достаточно минимального количества генетического материала патогена в образце биоматериала. Другие виды исследования могут оказаться ложноотрицательными из-за того, что в образце недостаточно много вирусов или бактерий или организм не успел выработать достаточное количество антител. ПЦР-анализ проводится на образце одного из следующих видов биоматериала: кровь, слюна, слизь, ткань, гной, мокрота, моча.
Этот процесс называется ПЦР с обратной транскрипцией. Обнаружение вирусной РНК с помощью ПЦР позволяет обеспечить диагностику COVID-19 на ранней стадии - до того, как организм выработает ответ в виде антител или даже до того, как у человека появятся симптомы заболевания. Тесты ПЦР играют решающую роль в предотвращении распространения заболеваний, так как часто позволяют выявить инфекции на ранней стадии, еще до появления симптомов.
Например, ПЦР-анализ мокроты используется при диагностике туберкулёза; Пунктаты и биоптаты органов и тканей, как правило, берутся при подозрении на онкологию. Исключение составляет биопсия желудка, которую проводят для определения наличия Helicobacter pylori — бактерии, вызывающей гастрит и язвенную болезнь. Хранение и транспортировка биоматериалов Пробы подлежат отправке в амплификатор не позднее, чем через 2 часа после забора, если они находятся в помещении при комнатной температуре. После оттаивания они должны быть сразу использованы, повторное замораживание запрещено.
В подавляющем большинстве случаев ПЦР-диагностика проводится «день в день»: пациент приходит в клинику, где у него берут мазок или кровь и сразу отправляют биоматериал в лабораторию, поэтому беспокоиться о правилах хранения не стоит. Как подготовиться к ПЦР-диагностике? Правила довольно просты: Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища спринцевания, свечи. Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию если таковая проводилась не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа; Кровь сдается из вены утром натощак; Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома. Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов — максимум 2 часа; Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой. Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз.
Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки. Результаты ПЦР-анализа Выше мы упоминали о качественной и количественной ПЦР-диагностике, так вот, в первом случае расшифровка результатов не представляет никакой трудности: ответ либо положительный, либо отрицательный. И если условия подготовки, сбора биоматериала, проведения анализа и оценки итогов не были нарушены, то нет и причин сомневаться в достоверности полученных данных. По-другому дело обстоит в случае с ПЦР количественной. Её результатом является число, демонстрирующее вирусную нагрузку. Чтобы понять, о какой цифре идёт речь, достаточно произвести умножение.
Содержание
- Анализ методом ПЦР. Что такое ПЦР-диагностика и для чего она используется
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности
- Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
- Микробиологические исследования
Что показывает анализ ПЦР
- Цепная реакция. Как работают тесты на коронавирус?
- Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?
- Рибосомальная 16S РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование биополимеров
- А как обнаружить скрытые инфекции у мужчин и женщин?
- ПЦР-диагностика
Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
| ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции | Методы исследования нуклеиновых. |
| Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). |
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
| Что такое анализ ПЦР и как его проводят | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе). |
| ПЦР-анализ: метод диагностики, выявляемые инфекции | Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. |
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
диагностика) считается одним из самых современных и точных методов молекулярной диагностики различных инфекций, в том числе урологических и гинекологических заболеваний. Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция, позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией.
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
Доставьте контейнер в лабораторное отделение в течение 2 часов после взятия биоматериала. Подготовка к ПЦР-анализу кала Кал следует сдавать до приёма антибиотиков или не ранее, чем через 12 часов после приёма препарата. За 72 часа до исследования откажитесь от использования ректальных свечей и масел, слабительных средств и клизм, а также прекратите приём препаратов, оказывающих влияние на работу кишечника и окраску кала. Соберите образец кала после естественного опорожнения кишечника без применения клизм или слабительных средств. Позаботьтесь о том, чтобы в биоматериал не попали посторонние примеси: вода, моча, выделения половых органов, дезинфицирующие средства и химические вещества, содержащиеся в подгузниках: перед дефекацией вымойте и высушите промежность; соберите кал с чистой и не впитывающей влагу поверхности: это может быть чистый пакет из полиэтилена, клеёнка, чистое судно или горшок.
Собирать кал из унитаза, пелёнок или подгузников — нельзя! Поместите 1—2 чайные ложки биоматериала в герметичный контейнер. Если нужно выполнить несколько анализов, подготовьте для каждого исследования отдельную порцию биоматериала в отдельном контейнере. Доставьте контейнер в лабораторное отделение в течение 2 часов после сбора.
Чтобы сохранить температуру контейнера, можно поместить его в термос с кубиком льда или в пакет с хладоэлементами. Если отслеживаете показатели в динамике, сдавайте каждый анализ при одинаковых условиях: в том же лабораторном отделении, тем же методом. Исследования для оценки эффективности лечения, как правило, проводят через 2—4 недели после приёма антибактериальных препаратов. Подготовка к ПЦР-анализу слюны За 24 часа до исследования по предварительному согласованию с лечащим врачом следует отказаться от терапии полости рта какими-либо лекарственными препаратами.
ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Появление ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики. В 1953 г. Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией. Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды.
Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления, т. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Клонирование ДНК Молекулярное клонирование - это совокупность экспериментальных методов в молекулярной биологии, которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организме хозяина. Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух различных организмов: вид, который является источником ДНК, подлежащей клонированию, и вид, который будет служить в качестве живого хозяина для репликации рекомбинантной ДНК. Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части а их сшивать с произвольными молекулами ДНК , разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома например, определенный ген. В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину по сравнению со всей ДНК клетки. Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет такой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве. Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было упрощенно рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Клонирование определяется как процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий с использованием организмов здесь репликация. Основной подход предполагает использование бысто делящихся организмов чаще всего бактериальных клеток, обычно E. В нашем разделе о клонировании ДНК рассмотрим клонирование с использованием клеток бактерий E. Процесс самой ПЦР полимеразной цепной реакции , как метод амплификаци нуклеиновых кислот in vitro рассмотрим отдельно Прим. Плазмида кодирует гены, регулирующие репликацию и контролирующие копийность 1—2 молекулы на клетку. Искусственные бактериальные хромосомы часто используются для секвенирования геномов организмов в различных проектах, например в проекте Геном человека. Короткий фрагмент ДНК исследуемого организма вставляется в хромосому, а затем амплифицируется и секвенируется. После этого прочитанные последовательности выравниваются in silico в результате чего получается полная последовательность генома организма. Сейчас такой подход был вытеснен более быстрыми и менее трудоёмкими методами секвенирования, например методом дробовика или методами секвенирования нового поколения. На рисунке - этапы BAC-клонирования фрагмента ДНК с использованием вектора плазмиды , содержащего ген lac Z изображены этапы до выделения плазмид с клонированным фрагментом рис. Этапы клонирования фрагмента ДНК с ипользованием кишечной палочки и вектора, содержащего ген lac Z все этапы см. Если вектор, содержащий такой ген, ввести в клетку E. Исходные мутантные клетки, не содержащие b-галактозидазу, не способны к этому превращению. Следовательно, на среде с X-Gal исходные нерекомбинантные клетки будут давать белые колонии, а рекомбинантные клетки - голубые. Процесс клонирования ДНК включает следующие этапы: Получение целевых фрагментов ДНК в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции ; Выбор вектора Вектор - молекула ДНК или РНК, способная переносить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом хромосомой. Вставка фрагмента ДНК в вектор; Введение вектора в популяцию восприимчивых клеток хозяина и трансформация с помощью вектора организма хозяина то есть поглощение бактериальной клеткой молекулы ДНК из внешней среды ; Отбор успешно трансформированной клетки обычно отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости ; Размножение отобранной клетки Выделение векторных молекул из клетки Выделение целевого фрагмента ДНК. Изображение этапов клонирования Рис. Схема клонирования участка ДНК гена в бактериях Поскольку при каждом клеточном делении бактерии как и другие клетки удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК. Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в специальный вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду небольшую относительно бактериальной хромосомы - кольцевую молекулу ДНК, реплицирующуюся отдельно от хромосомы. У бактерий «дикого типа» часто встречаются подобные структуры: они часто переносятся « горизонтально » между разными штаммами или даже видами бактерий. Чаще всего в них содержатся гены устойчивости к антибиотикам именно из-за этого свойства их и открыли или бактериофагам, а также гены, позволяющие клетке использовать более разнообразный субстрат. Иногда же они «эгоистичны» и не несут никаких функций Именно такие плазмиды обычно и используют в молекулярно-генетических исследованиях. В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации последовательность, с которой начинается репликация молекулы , целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой обычно, это гены устойчивости к какому-нибудь антибиотику. Плазмидная карта может быть прочитана путем понимания ее особенностей, таких как название и размер плазмиды, тип элементов в плазмиде и их относительное положение, а также ориентация промотора. В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент ДНК, после чего добавляют ее в культуру бактерий при специальных условиях, обеспечивающих трансформацию — процесс активного захвата бактерией ДНК из внешней среды риc. После этого проводят отбор бактерий, трансформация которых прошла успешно, добавляя соответствующий гену в плазмиде антибиотик: в живых остаются только клетки, несущие ген устойчивости а, следовательно, и плазмиду. Далее, после роста культуры клеток, из нее выделяют плазмиды, а из них с помощью рестриктаз выделяют «наш» фрагмент ДНК или используют плазмиду целиком. Если же ген вставили в плазмиду для того, чтобы получить его белковый продукт, необходимо обеспечить культуре условия для роста, а потом просто выделить требуемый белок. На этом месте сразу же должен возникать вопрос: как же все это возможно было использовать до того, как были расшифрованы геномы, да и чтение последовательности ДНК было еще дорогим и малораспространенным? Положим, с помощью рестрикции и клонирования полученных фрагментов мы получим библиотеку ДНК, то есть набор бактерий, несущих различные плазмиды, содержащие суммарно весь геном или заметную его часть. Но каким образом мы сможем понять, в каком из фрагментов содержится необходимый ген? Для этого использовали метод гибридизации. Сначала необходимо было выделить белок нужного гена. После чего отсеквенировать его фрагмент, обратить генетический код и получить последовательность нуклеотидов. В соответствии с ней химически синтезировали короткую молекулу ДНК которую, и использовали в качестве зонда для гибридизации. Стратегии ПЦР-клонирования Рис. Клонирование продуктов ПЦР. Клонирование ПЦР-продуктов ампликонов Традиционное клонирование основано на методах рекомбинантных ДНК, которые начинаются с подготовки вектора для получения ДНК-вставки путем расщепления каждого из них ферментами рестрикции. Затем расщепленные фрагменты сращиваются вместе ферментом, называемым лигаза, в процессе, известном как лигирование, с образованием нового вектора, способного экспрессировать интересующий ген. ПЦР-клонирование - это метод, при котором двухцепочечные фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР , лигируются непосредственно в вектор. ПЦР-клонирование предлагает некоторые преимущества по сравнению с традиционным клонированием, которое основано на расщеплении двухцепочечных вставок ДНК с помощью ферментов рестрикции рестриктазами для создания совместимых концов, очистки и выделения достаточных количеств и лигирования в аналогично обработанный вектор. ПЦР-клонирование - это метод клонирования, который значительно сокращает время и усилия, затрачиваемые на реакцию клонирования. Процедура клонирования ПЦР состоит из четырех следующих этапов: 1 Получение фрагмента гена с помощью ПЦР, 2 расщепление геномной ДНК , 3 лигирование в плазмидный вектор и 4 трансформация в бактерии, а затем бактерии будут реплицировать плазмиду. При ПЦР-амплификации этот метод клонирования требует гораздо меньше исходных шаблонных материалов, которые включают кДНК, геномную ДНК или другую плазмиду, несущую вставку. Кроме того, клонирование ПЦР обеспечивает более простой рабочий процесс, обходя требование о наличии подходящих сайтов рестрикции и их совместимости между вектором и вставкой. Тем не менее, существует ряд соображений, касающихся: праймеров для ПЦР и условий амплификации, выбора метода клонирования и используемых векторов клонирования и, наконец, подтверждения успешного клонирования и трансформации. Что касается ПЦР-амплификации интересующей последовательности, необходимо разработать праймеры и оптимизировать условия ПЦР компоненты и циклы для эффективной и специфической амплификации матрицы шаблона. Инструменты для конструирования праймеров доступны для биоинформационной оценки и выбора подходящих специфичных для мишени целевых последовательностей праймеров для амплификации. Для оптимизации ПЦР важны также концентрации компонентов реакции, температуры отжига и количество шаблонов. ТА-клонирование и клонирование по тупым концам Рис. Их выбор зависит от природы вектора и типа ПЦР-ферментов, используемых при клонировании. TA Клонирование также известное как быстрое клонирование - метод субклонирования который избегает помощи ферментов рестрикции рестрикционных эндонуклеаз или рестриктаз и легче и быстрее чем традиционное субклонирование. Этот метод основан на способности тимина Т и аденина А комплементарных базовых пар на различных фрагментах ДНК к гибридизации и, в присутствии лигазы, связываться вместе. Процедура использует терминальную трансферазную активность некоторых термофильных ДНК-полимераз, включая полимеразу Thermus aquaticus Taq. Технология клонирования TA значительно упрощает традиционное клонирование с помощью одноэтапной стратегии клонирования, которая устраняет необходимость в каких-либо ферментативных модификациях продукта ПЦР и не требует использования праймеров, содержащих сайты ферментов рестрикции. Клонирование по тупым концам клонирование тупого конца включает в себя лигирование вставки в линеаризованный вектор, где оба фрагмента ДНК не имеют выступов. Их корректорская активность улучшает точность последовательности амплифицированных продуктов. Однако здесь есть и ограничения, которые включают более низкую эффективность лигирования при вставке в тупые векторы клонирования и невозможность клонирования в прямом направлении. Для примера: Один из таких классов векторов включает в себя векторы клонирования Invitrogen TOPO одного из брендов известной биотехнологической корпорации Thermo Fisher Scientific , которые содержат ковалентно связанную ДНК-топоизомеразу I, которая функционирует как фермент рестрикции, так и лигазу. Его биологическая роль заключается в расщеплении и воссоединении ДНК во время репликации. Затем он отводит концы расщепленной нити и высвобождается из ДНК. Это позволяет векторам легко связывать последовательности ДНК с совместимыми концами Рис. Лигирование завершается всего за 5 минут при комнатной температуре. Очистка ПЦР помогает удалить соли, нуклеотиды, неспецифические ампликоны и праймеры-димеры. Путем построения библиотек ДНК, тысячи генетических фрагментов могут быть удобно архивированы и расширены для последующих применений, таких как генотипирование и фенотипический скрининг. Библиотеки гДНК служат полезными инструментами для изучения генетического состава различных видов или мутаций генов, возникающих при таких заболеваниях, как рак. С другой стороны, библиотеки кДНК, с другой стороны, полезны для анализа экспрессии генов и вариантов транскриптов, основанных на типе клетки и происхождении ткани пространственном , а также временных точках темпоральном. Обе стратегии включают извлечение нуклеиновых кислот, подготовку образцов например, рестрикционное расщепление , клонирование вектора, введение вектора в подходящего хозяина например, трансформацию или трансдукцию и клональный отбор. Поскольку исходные материалы различны между библиотекой гДНК и библиотекой кДНК, их выделение и подготовка используют различные подходы; однако после того, как фрагменты гДНК или кДНК будут клонированы в нужный вектор, можно следовать тому же рабочему процессу. Для подготовки геномной библиотеки, гДНК извлекается из организма, тканей или клеток, представляющих интерес. Извлеченную гДНК затем расщепляют, выделяют и лигируют в представляющий интерес вектор с совместимыми концами. Частичное расщепление генома часто осуществляется с помощью фермента рестрикции с преобладанием режущих участков, чтобы обеспечить перекрытие последовательности между фрагментами для картирования клонированных вставок Рис. Рисунок 25. Принципиальная схема полного и частичного расщепление фрагмента рестрикционным ферментом с четырьмя режущими участками. Частичное расщепление приводит к наложению последовательностей между фрагментами для отображения. Для простоты здесь показаны только некоторые возможные частично расщепленные фрагменты. Выбор вектора клонирования, в свою очередь, определяет способ доставки векторов, несущих вставку, в хозяина таблица 1 Таблица 1. Общие типы векторов, длины клонированных фрагментов и методы доставки векторов при создании библиотеки.
ПЦР-диагностика в настоящее время представляет собой очень детальный, сложный и многоэтапный процесс, поэтому вектором развития для лабораторий докладчик назвал внедрение современных автоматизированных и программных решений наравне с новыми тест-системами. Это поможет, во-первых, избежать ошибок, возникающих вследствие человеческого фактора, ведь в предыдущие два года, когда количество выполняемых исследований и нагрузка на сотрудников резко возросли, увеличилось и число ошибок, случаев контаминации и задержек выдачи результатов. Во-вторых, внедрение цифровизации ПЦР-диагностики увеличит пропускную способность лаборатории и поспособствует лавинообразному росту количества выполняемых анализов. В-третьих, это позволит сохранить все данные и сделать их доступными специалистам с любой момент. Максим Ионов подчеркнул, что в лабораториях существует не только физический поток образцов, который идет по всем этапам выполнения ПЦР-исследования, но и поток информации об образце — от направления на анализ до результата. Программа называется FRT Manager, и ее задача — автоматизировать ПЦР-амплификацию на всех этапах: до запуска термоциклера, во время его работы и после получения результатов. Интерфейс FRT Manager единый для всех этих приборов, что исключает ошибки, когда сотрудник переключается с одного термоциклера на другой.
ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится?
| Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом. |
| Принцип метода ПЦР (полимеразная цепная рекация), часть 1 (д.б.н. Ю.М. Романова) - YouTube | О сервисе Прессе Авторские права Связаться с нами Авторам Рекламодателям Разработчикам. |
| ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится? | Во-вторых, внедрение цифровизации ПЦР-диагностики увеличит пропускную способность лаборатории и поспособствует лавинообразному росту количества выполняемых анализов. |