Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. В середине 1990-х с помощью метода ПЦР-амплификации ДНК исследовали останки царской семьи Романовых. Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени.
Что такое ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – современный метод исследования, основанный на увеличении малых концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. При самолечении и самостоятельной сдаче анализов для исследования методом ПЦР в сетевой лаборатории высок риск того, что вы будете годами лечиться от несуществующей болезни. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. это метод диагностики, широко применяемый в современной медицине.
Рибосомальная 16S РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование биополимеров
Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. Основу процесса исследования составляет метод ПЦР в реальном времени, который зарекомендовал себя как очень быстрый и чувствительный способ, подчеркивают в Роспотребнадзоре.
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – современный метод исследования, основанный на увеличении малых концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Этот метод используется во всем мире при разработке тест-систем на основе ОТ-ПЦР, в том числе для диагностики РНК-содержащих вирусов, к коим относится и новый коронавирус SARS-CoV-2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — это точный метод лабораторной диагностики, который используют для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.
Актуальные методы диагностики COVID-19
Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА. Флуоресцентные методы детектирования продуктов ПЦР расширяют возможности применения. Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция, позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя.
ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания. Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. 6) автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа Метод ПЦР в реальном времени основан на детектировании сигнала флуоресценции, позволяющем наблюдать процесс накопления продукта в процессе реакции. Анализ крови методом ПЦР. ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одним из высокоточных методов, с помощью которого осуществляют диагностику инфекций различного характера, а в его основе лежит изучение генетических образцов материала человека.
Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная В. Она включает ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК, однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ. Одним из наиболее популярных является метод выделения ДНК, предложенный R. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого числа стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами и образующимся аэрозолем ДНК.
При классической процедуре фенольно-хлороформной экстракции ДНК достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex США , которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца. При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых способов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией.
В то же время использование подобных методов для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам вследствие применения в реакционной смеси некачественного препарата ДНК. Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов. Во время следующей процедуры - амплификации - образец, содержащий ДНК возбудителя, вносится в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание полимеразной реакции, два вида праймеров, два энзима Таg-полимераза и N-урацил-гликолаза и четыре вида нуклеотида A, Г, Ц, У. Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство термоциклер или ДНК-амплификатор , позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси. Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3 минут. Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что встречается нечасто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, то есть наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно.
Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенный на сегодняшний день - электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные.
На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается интеркалирует плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне 254 - 310 нм. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра 590 нм. В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. Размер неспецифических ампликонов может быть как больше, так и меньше по сравнению с «положительным контролем». В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные. В то же время препарат ДНК, подготовленный для ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя.
Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью, для чего используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль», который представляет собой любой стандарт ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда, например, используют р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций пришивают участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Если «внутренний контроль» внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК «внутреннего контроля» в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то, независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, «внутренний контроль» станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных тяжелых , чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси свидетельствует о нормальном прохождении реакции амплификации и отсутствии ингибиторов.
Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности: Методические указания. Молекулярная клиническая диагностика. Херрингтона, Дж.
Многочисленные открытия в области молекулярной биологии и генетики способствовали открытию ПЦР. В 1869 г. Мишер выделил вещество из клеток гноя, которое содержало азот и фосфор. Изначально вещество назвали нуклеином, а когда были определены его кислотные свойства нуклеиновой кислотой. В 1944 г. Эвери, К. Маклауда и М. В ходе этих экспериментов было доказано, что за трансформацией бактерий приобретением болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё убитых кипячением болезнетворных бактерий стоит выделенная из пневмококков ДНК. В 1952 г.
Херши и М. Чейзом был проведен эксперимент с помеченными радиоактивными изотопами ДНК и белками. В результате они выяснили, что в зараженную клетку передается только нуклеиновая кислота, а не белок, как считалось ранее. В 1949—1951 гг. Группа биохимика Э. Чаргаффа установила количественное соотношение между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК. Правила Чаргаффа и данные рентгеноструктурного анализа Розалинд Франклин сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК. На основе этих данных в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф.
Криком был установлен принцип комплементарности. Ученые сделали вывод о том, что ДНК представляет собой двойную полипептидную цепь, образующую спираль благодаря водородным связям между азотистыми основаниями аденин-тимин и гуанин-цитозин. В 1955 г. Для этого необходимо, чтобы праймер связался с цепью ДНК матрицей по принципу комплементарности. Чтобы реакция прошла раствор должен содержать нуклеозидтрифосфаты дНТФ , которые используются в качестве «строительного материала». В 1971 г. Клеппе с соавторами определили состав реакционной смеси, и принципы использования ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК.
В первую очередь она используется для диагностики различных инфекционных заболеваний. В связи с широкой распространенностью данной диагностической методики, у пациентов часто возникает вопрос: ПЦР анализ — что это такое?
Цена анализа относительно не высокая, несмотря на то, что процедура позволяет получить достоверный результат. Анализ крови ПЦР — что это такое? Полимеразная цепная реакция представляет собой исследование, суть которого заключается в проведении амплификации множественное копирование генетического материала инфекционного агента.
Для выбора наиболее оптимальной схемы лечения с включением в ее состав иммунотерапии либо таргетной терапии, клинические онкологи лечебных центров, входящих в структуру МИБС Онкологическая клиника МИБС, Центр протонной терапии МИБС используют данные NGS, полученные в собственной молекулярно-генетической лаборатории ПЦР полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция - это хорошо знакомый, точный и востребованный метод определения мутаций в указанных генах. С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. В таком случае невысокая стоимость и небольшой срок выполнения исследования, являющиеся преимуществом ПЦР при решении точечных диагностических задач при необходимости всестороннего изучения генов у онкологических пациентов не перекрывают определенных ограничений, которые присущи ПЦР. В первую очередь, это недостаточная информативность - один ПЦР-анализ позволяет проверить мутацию в одном конкретном гене, которую может предположить врач-онколог.
В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами: ПЦР исследование - позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов к. Гордиев М. Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога. Секвенирование по Сэнгеру С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера - низкая чувствительность.
Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов как следствие - пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным. Учитывая развитие и доступность в России в том числе по ОМС в МИБС более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии. При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика?
История открытия современных методов молекулярной диагностики
Скрининговый тест ИФА Принцип метода основан на способности искусственно созданных белков ВИЧ, улавливать вырабатывающиеся в организме человека специфические антитела. В результате взаимодействия, тест-система ИФА изменяет окрас индикатора. Полученные изменения цвета обрабатываются с помощью аппаратуры, которая выдает результат анализа. При этом необходимо учесть, что скрининговый тест предназначен для выявления не ВИЧ как такового, а антител к нему.
А поскольку для их появления в организме, необходимо время, то целесообразнее всего проводить скрининг спустя 3-6 недель после факта возможного инфицирования. Для этого достаточно всего 5 мл крови из вены пациента, забор которой проводят натощак, то есть спустя 7-8 часов после последнего приема пищи. Помимо положительного или отрицательного результата, тест ИФА может дать ложноположительный или ложноотрицательный результат.
Ложноположительный — речь может идти об сходных по своей структуре антителах, которые вырабатываются в организме при аутоиммунных заболеваниях, множественных миеломах, алкогольном гепатите и других патологиях. Ложноотрицательный — скорее всего, тестирование было проведено преждевременно или иммунная система слишком слаба и не вырабатывает антитела к ВИЧ. При сомнительном результате тест проводится повторно.
Иммунный блоттинг Иммуноблот — это основной метод диагностики ВИЧ, сочетающий иммуноферментный анализ ИФА с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску антигенов вируса. Для их выявления анализ проводят в три этапа: подготовка нитроцеллюлозной полоски; исследование пробы биологического материала пациента; трактовка результата. Таким образом, в ходе проводимого исследования, основные белки ВИЧ распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые проявляются при проведении иммуноферментной реакции и подтверждают наличие или отсутствие антител к антигенам ВИЧ.
Полученные в ходе исследования иммунным блоттингом результаты считаются окончательными.
Анатолий Ц. Обращался в клинику с деликатным вопросом! Всё быстро, чётко, по адекватной цене! Доктор Никитин, великолепный специалист!
Олег Журба Я благодарен своему врачу Волохову Е. По сути я в клинике и не лечился в итоге, а за то, что не смотря на свою специальность, он не зациклился на инфекциях и помог мне найти причину своих страданий. Я 4 года думал, что боль, которая мучила меня связана с простатитом и инфекциями. Я прошел около 10 курсов различного лечения антибиотиками, всякими массажами простаты, и ведь лечили меня все урологи, уверенные, что дело именно в этом. И к нему я приехал именно искать ИППП.
А оказалась грыжа диска позвонка. Блин, неужели никому в голову не могло прийти проверить это за 4 года? В итоге невролог, электрофорез, остеопат сделали свое дело. Вот такие дела. А лучшей рекомендацией для клиники и врача с моей стороны стал даже не этот отзыв, а уже 3 моих знакомых, ставших посетителями этого мед центра.
Написал лишь потому, что чувства благодарности переполняют!
И, наконец, в заключительной третьей стадии, "фермент-строитель" достраивает нити, восстанавливая ДНК. В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения амплификаций определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни тысяч или миллионы копий. Поначалу для каждой стадии использовали отдельную водяную баню, что сильно увеличивало время получения результата.
Поставить "на поток" метод помогли специальные автоматические термостаты - амплификаторы, в которых изменение температуры происходит по заданной программе. Современный амплификатор — сложный электронный прибор, не только управляющий циклами амплификации и поддерживающий необходимые температуры, но и делающий количественные замеры после каждого цикла. В её основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки. Для этого в состав реакционной смеси, наряду с праймерами и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки зонды.
Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается он него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула флуорофор , а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю. При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует. Дальше всё происходит, так же, как было описано выше: В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки. Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК.
При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора. Изготавливая молекулы флуорофора с разным цветом свечения можно проводить одновременный поиск разных возбудителей в одной пробирке. Большинство используемых сегодня, для ПЦР диагностики, амплификаторов , относится к классу автоматических, высокоскоростных многофункциональных Real Time аппаратов. Они позволяют проводить множественный ПЦР анализ до 5 мишеней цветных флуоресцентных красителей в 96 пробирках одновременно.
Это полностью автоматические термоциклеры со встроенным оптическим блоком и возможностью детекции накопления продуктов амплификации непосредственно в пробирке во время протекания реакции. Весь процесс амплификации протекает в закрытых одноразовых пробирках, считывание происходит через прозрачные стенки пробирок, без их открытия. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с тем, что называется "человеческим фактором". ПЦР — высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил устройства и оснащения лаборатории. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов.
Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, то есть осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. Создание программируемых термостатов амплификаторов , которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для их идентификации. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках.
При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки 20 нуклеотидных пар , называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Амплификация специфических фрагментов ДНК;.
Детекция продуктов амплификации. Выделение ДНК РНК На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Амплификация специфических фрагментов ДНК На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации.
Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Ее пять штрих-концов фиксируются ферментом ДНК-полимеразой, что обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплиментарной первой. То же самое, только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, однако, поскольку расплетение молекулы ДНК идет в обратном порядке, новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются. Для того чтобы фермент ДНК-полимераза начал свою работу, требуется наличие затравки или праймера - небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который, соединяясь с комплиментарным участком одной из цепей родительской ДНК, образует стартовый блок для наращивания дочерней нити.
Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная температура отжига праймеров - одна из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплиментарным последовательностям. Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера.
Фактически праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Такие фрагменты ДНК называются ампликонами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого.
Время отжига -20-60 сек. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой олигонуклеотиды длиной около 20 п. Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними.
Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дезоксирибонуклеотидфосфат. Этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой. Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК ампликона и т. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты.
С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, точнее, природой его клеточной стенки. Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная В. Она включает ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК спиртом.
Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК, однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ. Одним из наиболее популярных является метод выделения ДНК, предложенный R. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации.
Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого числа стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами и образующимся аэрозолем ДНК.
При классической процедуре фенольно-хлороформной экстракции ДНК достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex США , которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения.
В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.
ПЦР в режиме реального времени – новейшие технологии в диагностике инфекций
| Насколько достоверен тест ПЦР – Частная практика | Методы исследования нуклеиновых. |
| Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | РИА Новости | Дзен | Процесс самой ПЦР (полимеразной цепной реакции), как метод амплификаци нуклеиновых кислот in vitro рассмотрим отдельно (Прим. |
| Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры | Диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) показывает наличие половых инфекций с очень большой точностью. |
ПЦР в режиме реального времени – новейшие технологии в диагностике инфекций
Правильный способ использования внутреннего контрольного образца ВКО Повышение надежности ПЦР-тест-систем достигается, в том числе, за счет использования внутреннего контрольного образца ВКО. Для повышения точности и достоверности результатов ПЦР-исследования и их однозначного толкования в лабораторной диагностике, так же, как и в научных экспериментах, используют ряд контрольных экспериментов реакций. Помимо стандартных положительной и отрицательной контрольных реакций, в ПЦР-диагностике используют внутренний контрольный образец ВКО. Использование ВКО основано на возможности проведения в одной реакционной смеси нескольких практически независимых реакций амплификации для разных фрагментов ДНК мультиплексная ПЦР. Так, например, для контроля за эффективностью ПЦР можно использовать одновременное протекание двух реакций амплификации в одной пробирке. С помощью ВКО, добавляемого в образец перед этапом пробоподготовки очистки ДНК от примесей , можно проконтролировать эффективность всех этапов анализа.
Специалисты знают, что очень важным этапом разработки ПЦР-тест-системы является правильная разработка и использование ВКО внутреннего контрольного образца.
После изобретения метода ПЦР были изучены и зафиксированы уникальные нуклеотидные последовательности праймеры длиной 15-30 штук , характерные только для конкретного патогена. Если поместить такие праймеры в пробирку с исследуемым материалом, в котором есть ДНК или РНК «живых» патогенов, начнется реакция репликации — создание большого количества копий, которые можно визуально идентифицировать. И при расчете результатов сотрудники лаборатории могут определить, присутствуют ли в исследуемом образце определенные бактерии и вирусы, поэтому результаты анализа в основном качественные. Метод ПЦР строго специфичен и при правильном выполнении не может дать ложноположительного результата. То есть, если инфекции нет, анализ никогда не покажет, что она есть. Поэтому очень часто ПЦР-анализ проводится дополнительно для подтверждения диагноза, а также для того, чтобы определить патоген и его природу. Преимущества и недостатки На сегодняшний день ПЦР считается наиболее информативным способом определения возбудителей инфекционных заболеваний.
Диагностика с помощью этого метода позволяет найти возбудителя, присутствующего в исследуемых материалах. Это — наиболее точный анализ на половые инфекции, скрытые инфекции и другие заболевания, передающиеся половым путем. Кроме этого, с помощью ПЦР сегодня определяется наличие коронавируса и ряда других инфекционных болезней, которые передаются воздушно-капельным путем. Полимеразная цепная реакция является эффективным диагностическим инструментом, который позволяет врачу не только точно определить тип инфекционного возбудителя в организме пациента, но и выявить количество патогенов. Эта помогает обнаруживать хронические инфекции, например, вирусный гепатит. Отличие ПЦР-диагностики от других методик лабораторных исследований заключается в следующем: Метод направлен на идентификацию самого возбудителя. Диагностика универсальна и может использоваться для выявления нескольких патогенов. Для точной диагностики достаточно только одного биологического образца пациента.
Метод обладает высокой чувствительностью и не сопровождается другими перекрестными реакциями. Для анализа подходит любой биологический материал пациента: возможно изучение мазка, мочи, спермы и т.
Первые исследования проводились с элетрофоретической детекцией продуктов амплификации. Но полноценно в практику лабораторной диагностики метод ПЦР в нашем центре был внедрен с приобретением амплификаторов, с детекцией в режиме реального времени, с 2003г. На данный момент метод используется в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» в трех лабораториях: вирусологической, бактериологической и лаборатории особо опасных и природно-очаговых инфекций, по обширному кругу инфекций и для определения содержания ГМО в продуктах питания. В арсенале нашего Центра на сегодняшний день внедрены методики для обнаружения следующих патогенов: инфекции респираторного тракта вирусы гриппа А H1-swine pdm09 , Н5N1, H3N2 , грипп В , коронавирусы , риновирусы, метапневмовирусы, аденовирусы, РС-вирусы, бокавирусы, парагрипп 1,2,3,4 типа особо опасные и природно-очаговые инфекции возбудитель Сибирской язвы, холеры, ГЛПС, лептоспироз, туляремия, бруцеллез, лихорадка Западного мира, клещевой вирусный энцефалит, клещевой боррелиоз, гранулоцитарный анаплазмоз, моноцитарный эрлихиоз, микоплазма пневмония, хламидофила пневмония, возбудитель ТОРС кишечные инфекции норовирусы 1 и 2 геногруппы ,ротавирусы, астровирусы, Шигелла, энтероинвазивные E.
Особенности ПЦР — альтернатива клонированию для получения, в сущности, неограниченных количеств интересующей ДНК-последовательности. ПЦР за несколько часов может избирательно увеличить в количестве единственную молекулу ДНК до нескольких миллионов копий, что революционизировало как молекулярную диагностику, так и молекулярный анализ генетических болезней. ПЦР — ферментативное «умножение» или амплификация фрагмента ДНК, расположенного между двумя олигонуклеотидами, так называемыми праймерами. Праймеры разрабатывают таким образом, что первый комплементарен одной нити молекулы ДНК с одной стороны целевой последовательности, а второй — другой нити противоположной стороны этой же последовательности. Затем, используя последовательность между праймерами как шаблон, с помощью ДНК-полимеразы синтезируются две новые нити ДНК. Вновь синтезированные комплементарные нити ДНК формируют следующую копию исходной целевой последовательности. Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту 2, 4, 8,16, 32,...