Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydia trachomatis. Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты.
ПЦР-исследования
За разработку ПЦР-метода он был удостоен Нобелевской премии в области химии в 1993 г. Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 30 лет и позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. Этот метод нашел применение в: диагностике инфекционных заболеваний, в том числе вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию: в клинической диагностике вирусных и бактериальных инфекций; диагностике наследственных муковисцидоз, фенилкетонурия, гемофилия , онкологических и др. Кроме того, молекулярные методы используются в таких областях, как эпидемиология, фармакология, экология, сельское хозяйство, пищевая промышленность, биотехнология. Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность. История открытия и разработка метода пцр Молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого.
Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3 минут. Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов.
Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что встречается нечасто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, то есть наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенный на сегодняшний день - электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу.
При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается интеркалирует плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне 254 - 310 нм. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра 590 нм. В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. Размер неспецифических ампликонов может быть как больше, так и меньше по сравнению с «положительным контролем». В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные. В то же время препарат ДНК, подготовленный для ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя.
Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью, для чего используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль», который представляет собой любой стандарт ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда, например, используют р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций пришивают участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Если «внутренний контроль» внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК «внутреннего контроля» в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то, независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, «внутренний контроль» станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных тяжелых , чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси свидетельствует о нормальном прохождении реакции амплификации и отсутствии ингибиторов. Если ампликоны нужного размера и «внутреннего контроля» не образовались, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК. Несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Так, если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с «внутренним контролем» за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в исследуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам.
Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры этот способ контроля эффективности амплификации, безусловно, будет весьма полезен. Метод горизонтального электрофореза Одним из методов визуализации результатов амплификации является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле. Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов. Метод вертикального электрофореза Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом.
Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют. Метод гибридизационных зондов В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды" со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически.
И ни один честный врач не скажет вам наверняка, насколько эта находка опасна для здоровья, и каков достоверный риск осложнений. Поэтому решите для себя заранее, сможете ли вы спокойно жить дальше или будете лечить результаты анализа даже в тех случаях, когда до похода в клинику у вас не было никаких проблем с интимным здоровьем. Иначе обстоят дела с обследованием на ЗППП в группе риска — у людей с рискованным сексуальным поведением и беременных женщин. Им необходимо периодически сдавать анализы на половые инфекции, даже если нет никаких жалоб на здоровье. Сексуальным экстремалам профилактическое обследование нужно, чтобы выявить факт инфицирования еще до появления симптомов и как можно раньше принять меры для защиты своих половых партнеров от заражения. Беременным женщинам диагностика ЗППП необходима, потому что многие мамины инфекции передаются будущему малышу. Даже если нет симптомов у женщины, последствия для ребенка могут быть тяжелыми. Согласно принятым государственным программам как в нашей стране , так и в США , профилактическая диагностика скрининг на ЗППП проводится только среди людей с рискованным сексуальным поведением и у беременных женщин. Скрининг на герпес и ВПЧ не проводят даже в группе риска. Для остальных людей при отсутствии жалоб и клинических проявлений обследование на ЗППП вообще не рекомендуется. Забор материала — дело нескольких минут. Врач делает это с помощью стерильного зонда в виде ватной палочки, щетки, «ершика» или специальной ложки. Источник: hemltd. По настоящему скрытые инфекции — это редкость. Гораздо чаще встречаются не скрытые, а забытые инфекции: когда вроде что-то было, но само прошло, хотя инфекция никуда не делась, а только перешла в вялотекущую форму. Дело в том, что многие половые инфекции имеют волнообразное течение. Первые симптомы быстро пропадают без лечения. Затем наступает так называемая «скрытая» стадия: субъективные жалобы отсутствуют, человек считает, что выздоровел, но инфекция медленно развивается, вызывая хроническое воспаление. Спустя какое-то время симптомы болезни обычно возвращаются, только уже вместе с осложнениями. Поэтому любые проблемы в интимной сфере решайте безотлагательно. И еще!
Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится. В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели ПААГ и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует. А Электрофорез в полиакриламидном геле Рис. Электрофорез в полиакриламидном геле чаще используется для белков Электрофорез в полиакриламидном геле ПААГ или PAGE - метод, широко используемый для разделения биологических макромолекул в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Как и во всех формах гель-электрофореза, молекулы могут работать в своем естественном состоянии, сохраняя структуру молекул более высокого порядка, или может быть добавлен химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную линейную цепь, подвижность которой зависит только от ее длины и отношение массы к заряду. Таким образом, разделяют т. Базовые приготовления Образцы могут представлять собой любой материал, содержащий белки. Они могут быть получены биологически, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, проб окружающей среды или очищенных белков. Образец для анализа необязательно смешивают с химическим денатурантом, обычно SDS для белков. SDS - это анионный детергент, который денатурирует вторичные и недисульфидно-связанные третичные структуры и дополнительно придает отрицательный заряд каждому белку пропорционально его массе. Приготовление акриламидных гелей Гели обычно состоят из акриламида, бисакриламида, необязательного денатурирующего вещества SDS и буфера с отрегулированным pH. Раствор можно дегазировать под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации. Источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED, добавляются для инициирования полимеризации. Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида, который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами полиакриламида. Гели, как правило, полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в гелеобразователе, с гребнем, вставленным вверху для создания лунок для образца. После того, как гель полимеризован, «расческа» может быть удалена, и гель готов для электрофореза. Электрофорез В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными. Электрическое поле воздействует на гель, заставляя отрицательно заряженные белки мигрировать через гель от отрицательного электрода катода к положительному электроду аноду. В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: маленькие молекулы легче проникают через поры в геле, в то время как более крупные имеют большую сложность. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; Миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях. По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы движутся дальше вниз по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Следовательно, биомолекулы могут быть разделены примерно в соответствии с размером, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле. Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру. Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля. Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов. Справа - Установка для проведения электрофореза в геле. Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков. Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть. Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис. Схема проведения Саузерн-блоттинга Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern — «северный». Денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE Выше мы рассмотрели основные принципы работы гель-электрофореза. Однако все чаще в литературе, посвященной исследованиям по секвенированию ДНК, можно встретить информацию об использовании метода ДГЭ или денатурирующего градиентного гель-электрфореза. В частности упоминается о т. Обнаружено, что определенные денатурирующие гели способны индуцировать расплавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие небольшие, как 200-700 пар оснований. Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным условиям денатурации, расплавленные нити полностью распадаются на отдельные нити. Процесс денатурации на денатурирующем геле очень резкий большинство фрагментов плавятся в пошаговом процессе. Дискретные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий. Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательности фрагментов одинаковой длины часто приводят к тому, что они частично плавятся в разных положениях градиента и поэтому "останавливаются" в разных положениях геля. На чем основан метод DGGE? Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления, т. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Клонирование ДНК Молекулярное клонирование - это совокупность экспериментальных методов в молекулярной биологии, которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организме хозяина. Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух различных организмов: вид, который является источником ДНК, подлежащей клонированию, и вид, который будет служить в качестве живого хозяина для репликации рекомбинантной ДНК. Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части а их сшивать с произвольными молекулами ДНК , разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома например, определенный ген. В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину по сравнению со всей ДНК клетки. Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет такой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве. Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было упрощенно рассказано выше.
Преимущества обращения в нашу клинику
- ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
- ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
- Выбор цветовой схемы:
- Метод ПЦР диагностики: сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции
- Достоинства и недостатки
- Диагностика COVID-19: обзор основных методов
ПЦР анализ: что это такое?
В 1960-х Хар Гобинд Корана продолжил изучение механизмов синтеза нуклеиновых кислот. В частности, в его лаборатории впервые синтезировали целый ген. Корана продемонстрировал, что такой искусственно созданный фрагмент ДНК нормально функционирует, встроив его в геном Escherichia coli 4. Кроме того, исследователь занимался расшифровкой генетического кода и его роли в синтезе белков. Позднее, в 1976 году из этой бактерии был выделен особый тип ДНК-полимеразы: Taq-полимераза 6. В 1971 году Хьель Клеппе с коллегами представили теоретическое описание механизма создания множества копий заданного фрагмента ДНК, или амплификации 7. Этот механизм очень близок к тому, что предложил в 1984 году создатель ПЦР Кэри Муллис для своей методики. В связи с этим ему иногда приписывают первенство в изобретении технологии ПЦР. В 1977 году Фредерик Сенгер разработал метод определения нуклеотидной последовательности ДНК секвенирование по Сенгеру , который основан на достройке второй ДНК цепи мечеными нуклеотидами, что позволяет однозначно детектировать их порядок.
Эти и другие открытия подготовили почву для того, чтобы в 1984 году Кэри Муллис предложил технологию, позволяющую специфически амплифицировать короткие ДНК-фрагменты в искусственных условиях — метод ПЦР. Хронологическая последовательность ключевых открытий, которые послужили основой для создания технологии ПЦР. Сегодня, когда метод ПЦР стал неотъемлемой составляющей как биологических наук, так и медицины, практически невозможно представить, что потребовалось немало времени, прежде чем эта методика заслужила внимание специалистов. Между тем, это было именно так! И на то было две основных причины. Ученому пришлось изрядно потрудиться, чтобы убедить руководителей в исключительных перспективах разработанного им метода. Во-вторых, ПЦР-технология в том виде, в котором она была предложена Кэри Муллисом, требовала доработки. Из-за этого полимеразу приходилось добавлять после каждого цикла, что существенно увеличивало как стоимость реактивов, так и времязатраты экспериментатора.
Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте — РНК. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний бактерии, грибки и вирусы были созданы свои специфические генетические детекторы праймеры - уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации — создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, то есть «обнаружено» или «не обнаружено».
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР? Со слов американского биохимика Керри Мюллиса Kary Mullis , идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода ДНК пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга Arthur Kornberg , которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества. Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры.
И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов. Как это все происходит в лаборатории Выделение ДНК Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата. Амплификация увеличение числа копий ДНК Важнейший этап исследования.
Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
В связи с широкой распространенностью данной диагностической методики, у пациентов часто возникает вопрос: ПЦР анализ — что это такое? Цена анализа относительно не высокая, несмотря на то, что процедура позволяет получить достоверный результат. Анализ крови ПЦР — что это такое? Полимеразная цепная реакция представляет собой исследование, суть которого заключается в проведении амплификации множественное копирование генетического материала инфекционного агента. Оно необходимо для последующей идентификации генома и видовой принадлежности микроорганизмов.
Этот метод позволяет выделить в исследуемом материале уникальный участок генетической информации любого организма. В настоящее время ПЦР широко применяется в следующих отраслях: в генетических исследованиях, диагностике инфекционных заболеваний, для определения ГМО в продуктах питания, в ветеринарии, растениеводстве и судебно-медицинской экспертизе, позволяя производить разнопрофильные исследования на минимальном оборудовании, с привлечением меньшего количества квалифицированного персонала по сравнению с другими методами. Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды. ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании при скрининговой детекции вирусных и бактериальных возбудителей ОКИ в лабораторной диагностике и санитарно-эпидемиологическом надзоре.
Цепная реакция. Как работают тесты на коронавирус?
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях in vitro. Метод ПЦР имеет очень высокую информативность и позволяет легко и эффективно определять наличие микобактерии в организме, но, только если проводить анализ мокроты если это туберкулез органов дыхания или мочи при туберкулезе орагнов мочевыделительной системы , а не крови. ПЦР анализ крови на туберкулез нельзя считать информативным, так как ДНК микобактерии туберкулеза в крови бывает только у больных туберкулезным сепсисом, что на практике встречается весьма редко. Полимеразная цепная реакция ПЦР позволяет всего в течение нескольких часов обнаружить возбудителя инфекции, причем выявить можно даже 1-2 молекулы среди огромного количества.
Этот процесс называется ПЦР с обратной транскрипцией. Обнаружение вирусной РНК с помощью ПЦР позволяет обеспечить диагностику COVID-19 на ранней стадии - до того, как организм выработает ответ в виде антител или даже до того, как у человека появятся симптомы заболевания. Тесты ПЦР играют решающую роль в предотвращении распространения заболеваний, так как часто позволяют выявить инфекции на ранней стадии, еще до появления симптомов. Количественный ПЦР-анализ позволяет оценить инфекционную нагрузку на организм, а также используется для анализа изменений экспрессии генов в опухолях.
Важна также и высокая скорость проведения исследования. В отличие от традиционного посева при выявлении бактериальных инфекций, который занимает несколько дней, ПЦР тест обычно выполняется в течение суток. Это значительно увеличивает вероятность назначения своевременного лечения. Кроме того, с помощью ПЦР можно определить латентных носителей инфекции. Необходимо строго соблюдать правила сбора биоматериала и его хранения. Важно выбрать правильное время взятия биоматериала и выполнить правила подготовки к тесту. В частности, это касается и нового коронавируса, который присутствует в выделениях носоглотки и ротоглотки только в течение определенного времени, по истечении которого анализ окажется отрицательным.
Кроме того, высокая чувствительность ПЦР может иногда превращаться из преимущества в недостаток.
Клиники предлагают готовые пакеты услуг: ПЦР на разное количество инфекций — от 3 до 16. На самом деле метод полимеразной цепной реакции действительно незаменим только при определении четырех возбудителей половых инфекций, это: ВПЧ HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и др. Из этого списка ПЦР на ВПЧ назначают женщинам старше 30 лет 1 раз в пять лет или тогда, когда есть изменения на шейке матки.
ПЦР на герпес при отсутствии проявлений инфекции не имеет никакого смысла. Остается анализ ПЦР на микоплазму и хламидию — это мелкие бактерии, выявить их другими методами можно, но гораздо сложнее. Хламидии вызывают всевозможные воспаления в мочеполовой системе. Хроническая инфекция может осложняться образованием спаек в малом тазу, а значит болями и, возможно, бесплодием.
Считается, что даже бессимптомный хламидиоз опасен, хотя достоверных данных и прогнозов на этот счет нет. По существующим стандартам , если хламидию нашли, это нужно лечить. Чтобы выявить микоплазменную инфекцию, сдают количественный ПЦР, чтобы определить, сколько именно бактерий поселилось внутри. Только микоплазма гениталиум считается патогеном, если она обнаружена в анализах, требуется лечение.
Количество микробных клеток и наличие симптомов не имеет значение. Для других инфекций, передающихся половым путем, существуют не менее достоверные, но более дешевые и простые анализы: на сифилис — анализ крови на антитела, микроскопия отделяемого половых органов при наличии проявлений инфекции; на гонорею, трихомониаз, кандидоз — микроскопия мазка, бактериологический анализ; на ВИЧ, гепатиты В, С — ИФА и ПИФ — иммунологические исследования крови. Простой мазок и бактериологический анализ дают, порой, гораздо больше информации об интимном здоровье, чем ПЦР на 16 инфекций, так как показывают не только наличие и количество возбудителя, но и его чувствительность к различным антибиотикам, а также признаки воспаления. Резюме 1.
Найдите доверенного гинеколога или уролога для мужчин и посещайте его раз в полгода-год даже если ничего не беспокоит. Врач направит вас на обследование, если будет необходимость. Появились жалобы со стороны мочеполовых органов, особенно если вы не исключаете инфекцию, постарайтесь посетить врача в течение нескольких дней. Если ваша интимная жизнь подходит под определение «рискованной» , сдавать анализы на ЗППП нужно после каждой смены полового партнера, но не реже, чем раз в полгода.
Анализ ПЦР оправдан для диагностики хламидиоза, микоплазмоза и вирусных инфекций — по показаниям. Сифилис, гонорея, трихомониаз, кандидоз, ВИЧ-инфекция и гепатиты качественно определяются другими способами.
Работа с малым количеством ДНК материала. Мы уже успели привыкнуть к тому, что можно быстро и недорого определить причину недомогания, сделать генетический анализ. Но это стало возможно не так давно. Столь резкий прогресс в медицинской диагностике во многом обязан одной технологии, а именно — полимеразной цепной реакции. За время эпидемии коронавируса вы почти наверняка сталкивались с ее аббревиатурой — ПЦР. Чтобы доказать, что вы здоровы, нужно было сделать «ПЦР-тест», подтверждающий отсутствие в организме коронавирусного генетического материала. Именно об этой технологии мы и расскажем в нашей статье. Кэри Муллис: создатель технологии ПЦР.
Ниже мы кратко резюмируем суть и значение наиболее важных для возникновения ПЦР работ см. В 1953 году исследователи Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовали работу 2 , которая внесла существенный вклад в понимание структуры ДНК — молекулы, в которой зашифрована уникальная для каждого организма генетическая информация. Именно эта информация является ключом как к определению вида организма, что необходимо для детектирования патогена, так и к выявлению генетических особенностей и заболеваний человека методом ПЦР. В 1950-х гг. Артур Корнберг изучал механизмы репликации, или самоудвоения, ДНК. Ему же удалось впервые осуществить синтез ДНК вне живой клетки, в пробирке. А в 1957 ученый вместе со своей научной группой выделил из бактерии Escherichia coli первую ДНК-полимеразу 3 — ключевой фермент, обеспечивающий синтез ДНК. В 1960-х Хар Гобинд Корана продолжил изучение механизмов синтеза нуклеиновых кислот. В частности, в его лаборатории впервые синтезировали целый ген.
Диагностика COVID-19: обзор основных методов
читайте в медицинском журнале клиники Адмиралтейские Верфи. Флуоресцентные методы детектирования продуктов ПЦР расширяют возможности применения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков.
Какой лучше: достоинства и недостатки разных методов молекулярной диагностики
- Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
- Принцип метода ПЦР (полимеразная цепная рекация), часть 1 (д.б.н. Ю.М. Романова) - YouTube
- Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
- Принципы ПЦР-диагностики. Реферат. Медицина, физкультура, здравоохранение. 2013-05-03
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) или ОТ-ПЦР в диагностике текущей инфекции. Диагноз COVID-19 устанавливается путем выявления РНК SARS-CoV-2 при помощи МАНК или ОТ-ПЦР.
Что такое ПЦР
В России метод полимеразной цепной реакции был внедрен и начал использоваться в 1995 г. Во-вторых, внедрение цифровизации ПЦР-диагностики увеличит пропускную способность лаборатории и поспособствует лавинообразному росту количества выполняемых анализов. Узнайте, что такое ПЦР-анализ, виды тестов и показания к проведению диагностики, преимущества и недостатки метода.
Преимущества и недостатки
- Что выявляет анализ ПЦР
- ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
- Полимеразная цепная реакция — Википедия
- А как обнаружить скрытые инфекции у мужчин и женщин?
Что такое ПЦР анализ
Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды. Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа. Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач. ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами. О сервисе Прессе Авторские права Связаться с нами Авторам Рекламодателям Разработчикам.