читайте в нашей статье. ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека.
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
| ПЦР в режиме реального времени – новейшие технологии в диагностике инфекций | 40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост. |
| Актуальные методы диагностики COVID-19 | это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. |
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
В середине 1990-х с помощью метода ПЦР-амплификации ДНК исследовали останки царской семьи Романовых. Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. читайте в медицинском журнале клиники Адмиралтейские Верфи. Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты.
Улучшение качества обследования пациентов с помощью ПЦР-лаборатории
Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4. В настоящее время преимущество ПЦР-анализа перед культуральным методом обнаружения микроорганизмов состоит в следующем:. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма. Время, необходимое для обнаружения возбудителя культуральным методом, составляет около 4 суток, тогда как использование ПЦР позволяет обнаружить микроб через 4-5 часов. Использование технологии ПЦР позволяет проводить определение возбудителей, например хламидий, в образцах, взятых неинвазивным путем, например в порциях мочи. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Данный метод сравним по трудоемкости с классическими методами иммуноферментным, иммунофлуоресцентным и т. Поэтому метод ПЦР, наравне с культуральным методом, признается «золотым стандартом» для диагностики инфекционных заболеваний.
В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Обычно этот интервал составляет 4-8 недель. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа. Последние два пункта важны для разработчиков ПЦР-диагностикумов. В настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя , которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок. Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого.
Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны за исключением случая однояйцевых близнецов , родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм.
В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина.
Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции. Особую диагностическую ценность ПЦР для обнаружения этого вируса представляет по следующим причинам: отсутствие способа культивирования ВГС; 2 наборы для антигенной диагностики не существуют; 3 реакция образования антител к ВГС настолько замедлена, что диагноз во время острой фазы инфекции, как правило, поставить невозможно. Поэтому в настоящее время становится общепризнанным использование технологии ПЦР для диагностики, контроля качества лечения и эпидемиологического анализа заболеваемости, обусловленной ВГС. При этом только технология ПЦР позволяет решать следующие задачи: 1 проводить диагностику острой инфекции при позднем выявлении антител к ВГС; 2 осуществлять этиологическую диагностику хронического гепатита С у иммуносупрессированных пациентов; 3 оценивать эффективность противовирусной терапии; 4 выявлять виремию у доноров крови с нормальным уровнем аминотрансфераз; 5 определять возможную контаминацию препаратов крови; 6 оценивать широту распространения ВГС. Диагностика этих возбудителей традиционными методами микроскопии и бакпосева неэффективна. ПЦР позволяет не только диагностировать хламидиозы и микоплазмозы, но и проводить видовую идентификацию возбудителя С. Использование метода ПЦР позволяет значительно улучшить раннюю диагностику туберкулеза. В настоящее время разработаны и появились на рынке ПЦР-наборы для определения устойчивости микобактерий к антибиотикам.
Наиболее эффективным методом анализа крови на присутствие этих возбудителей является метод ПЦР. Это цитомегаловирус, токсоплазмы, вирус герпеса, вирус краснухи, микоплазмы, хламидии и др. Использование серологических тестов для определения этих инфекций у новорожденных неэффективно, поскольку формирование иммунной системы у ребенка происходит в течение нескольких месяцев, и наличие инфекционного агента может не сопровождаться выработкой специфических антител. С другой стороны, в крови новорожденного длительное время могут присутствовать материнские антитела класса IgG, способные проникать через плацентарный барьер. Таким образом, наличие специфических IgG у ребенка в первые месяцы жизни не свидетельствует о присутствии возбудителя. Применение ПЦР-анализа значительно увеличивает возможности диагностики неонатальных инфекций, в том числе и на внутриутробном этапе. Для заболеваний, вызываемых этими возбудителями, характерна стертость клинической симптоматики, хроническое течение, часто приводящее к поражению репродуктивных функций - невынашиванию беременности, бесплодию. Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, проведенные в крупных клиниках разных странах, показали высокую эффективность данного метода.
Признано, что по показателям чувствительности и оперативности ПЦР превосходит культуральный метод, принятый в качестве "золотого стандарта". Метод ПЦР-диагностики дополняет уже существующие приемы микробиологической диагностики, качественно меняет методологию решения прикладных проблем медицинской микробиологии и эпидемиологии. Учитывая вышесказанное, сформулируем направления исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль.
Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем наборов реагентов в случаях, где использование транспортной среды является необходимым.
Сразу после взятия плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек. При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгиваний и расплескиваний, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей. При переносе клинического материала из пробирок, флаконов в новые использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами. Строго соблюдать правила хранения и транспортирования клинических проб.
Охлаждающие элементы перед транспортированием клинического материала замораживать до необходимой температуры. Для проведения пробоподготовки используют ПЦР-боксы. Чтобы смешать необходимые для исследований реагенты используют центрифуги и вортексы. Чтобы извлечь реакционную смесь и прочие материалы применяют автоматические дозаторы.
Помещения иоборудование лаборатории ПЦР. Рабочие зоны представляют собой боксированные помещения, состоящие из бокса и предбокса, соответствующим образом промаркированы. В рабочей зоне 1 осуществляют прием материала, его маркировку, регистрацию в специальном журнале, первичную подготовку. В рабочей зоне 2 проводят выделение и очистку нуклеиновых кислот микроорганизмов из проб, подготовленных в рабочей зоне 1.
В рабочей зоне 3 осуществляют приготовление реакционных смесей, проведение обратной транскрипции. В рабочей зоне 4 проводят амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации. Результаты ПЦР анализа на инфекции обычно выглядят как таблица. В первой колонке идут виды возбудителей, определенных в ходе анализа.
Во второй результаты. Таким образом, технология ПЦР обеспечивает возможность изучения и диагностики хронических инфекционных процессов, экологии возбудителей инфекционных заболеваний и открывает новые перспективы в медицинской диагностике.
Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем ЗППП , таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции. Кровь, плазма, сыворотка.
Как подготовиться к сдаче анализа? Достоверность результата ПЦР напрямую зависит от правильности сдачи материала на обследование. Материал не должен быть загрязнен, иначе результат исследования не будет объективен. К наиболее важным рекомендациям перед сдачей анализа ПЦР относятся следующие требования: Моча сдается утром в стерильный контейнер. Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время. Не стоит проявлять половую активность за сутки до проведения анализа.
Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках коротких двунитевых участках.
Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой олигонуклеотиды длиной около 20 п. Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дезоксирибонуклеотидфосфат. Этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой. Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК ампликона и т. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу.
Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, точнее, природой его клеточной стенки. Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная В. Она включает ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК, однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ. Одним из наиболее популярных является метод выделения ДНК, предложенный R. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации.
Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого числа стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами и образующимся аэрозолем ДНК. При классической процедуре фенольно-хлороформной экстракции ДНК достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex США , которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике.
Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца. При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых способов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время использование подобных методов для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам вследствие применения в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.
Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов. Во время следующей процедуры - амплификации - образец, содержащий ДНК возбудителя, вносится в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание полимеразной реакции, два вида праймеров, два энзима Таg-полимераза и N-урацил-гликолаза и четыре вида нуклеотида A, Г, Ц, У. Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство термоциклер или ДНК-амплификатор , позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси. Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3 минут. Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что встречается нечасто.
Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, то есть наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенный на сегодняшний день - электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации.
Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается интеркалирует плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне 254 - 310 нм.
Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра 590 нм. В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма.
Рибосомальная 16S РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование биополимеров
Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) или ОТ-ПЦР в диагностике текущей инфекции. Диагноз COVID-19 устанавливается путем выявления РНК SARS-CoV-2 при помощи МАНК или ОТ-ПЦР. Основу процесса исследования составляет метод ПЦР в реальном времени, который зарекомендовал себя как очень быстрый и чувствительный способ, подчеркивают в Роспотребнадзоре. ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика. Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет.
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
Согласно внесенным изменениям в санитарные правила, при контакте с зараженным коронавирусной инфекцией тест на COVID-19 методом ПЦР следует делать только при появлении симптомов. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydia trachomatis. Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды.
Достоверность метода ПЦР
• При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач.
Диагностика ВИЧ: методы и исследования
Полимеразная цепная реакция ПЦР позволяет всего в течение нескольких часов обнаружить возбудителя инфекции, причем выявить можно даже 1-2 молекулы среди огромного количества. С помощью этой диагностики можно своевременно не только обнаружить инфекцию, но и изолировать человека, назначив ему соответствующее лечение. Чтобы провести полимеразную цепную реакцию на устойчивость, используют гены, запоминающие невосприимчивость к некоторым лекарствам, после чего через двое суток можно получить результат. Эта методика позволяет не только выявить ДНК возбудителя туберкулеза, но и те его мутации, которые указывают на устойчивость к препаратам противотуберкулезного ряда.
Подготовка к исследованию Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала[10]. Кровь сдается натощак утром.
Мочу также следует собрать утром в стерильный контейнер и сдать в лабораторию в ближайшие два часа. Перед взятием мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации. Пациент, принимающий какие-либо лекарственные препараты или БАД, должен сообщить об этом врачу: возможно придется остановить курс приема, так как действующие вещества средства могут исказить результаты лабораторного анализа. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.
Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение. Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Значит, заболевание находится на очень ранней стадии развития.
Исключение составляет биопсия желудка, которую проводят для определения наличия Helicobacter pylori — бактерии, вызывающей гастрит и язвенную болезнь. Хранение и транспортировка биоматериалов Пробы подлежат отправке в амплификатор не позднее, чем через 2 часа после забора, если они находятся в помещении при комнатной температуре.
После оттаивания они должны быть сразу использованы, повторное замораживание запрещено. В подавляющем большинстве случаев ПЦР-диагностика проводится «день в день»: пациент приходит в клинику, где у него берут мазок или кровь и сразу отправляют биоматериал в лабораторию, поэтому беспокоиться о правилах хранения не стоит. Как подготовиться к ПЦР-диагностике? Правила довольно просты: Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища спринцевания, свечи. Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию если таковая проводилась не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа; Кровь сдается из вены утром натощак; Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома.
Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов — максимум 2 часа; Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой. Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз. Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки. Результаты ПЦР-анализа Выше мы упоминали о качественной и количественной ПЦР-диагностике, так вот, в первом случае расшифровка результатов не представляет никакой трудности: ответ либо положительный, либо отрицательный. И если условия подготовки, сбора биоматериала, проведения анализа и оценки итогов не были нарушены, то нет и причин сомневаться в достоверности полученных данных. По-другому дело обстоит в случае с ПЦР количественной.
Её результатом является число, демонстрирующее вирусную нагрузку. Чтобы понять, о какой цифре идёт речь, достаточно произвести умножение. Сколько стоит сдать ПЦР?
Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации. Анализ ДНК, генерируемой в ходе ПЦР, может быть выполнен менее чем за один день, существенно облегчая разработку и клиническое использование большого числа диагностических ДНК-тестов. Сначала, с помощью того же фермента обратной транскриптазы, которую используют для изготовления библиотек клонов кДНК, на основе интересующей мРНК синтезируется однонитевая кДНК. Один из олигонуклеотидов запускает синтез второй нити кДНК, полученная двойная спираль затем служит в качестве объекта ПЦР. ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика. Она позволяет обнаружить, проанализировать и измерить специфические последовательности гена в образце ДНК пациента, не клонируя его и не прибегая к блоттингу.
Анализ можно выполнять даже из нескольких клеток буккального эпителия после полоскания рта, из единственной клетки, взятой у 3-дневного эмбриона, содержащего четыре или восемь клеток, из спермы во влагалищном тампоне, полученном от жертвы изнасилования, или из капли сухой крови на месте преступления.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
В России метод полимеразной цепной реакции был внедрен и начал использоваться в 1995 г. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. производстве и внедрении высокотехнологичного оборудования и реагентов для исследований методом ПЦР. В качестве материала для исследований методом полимеразной цепной реакции выступают кровь, моча, слюна, мокрота, ликвор, биоптаты тканей, соскобы со слизистых оболочек.