Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий увеличить изначально низкую концентрацию заданной последовательности ДНК в растворе так, что ее присутствие становится детектируемым визуально. ПЦР в реальном времени (реал-тайм): методика и преимущества (д.б.н. Ю.М. Романова, ч. 2). В России тестирование на грипп будет проводиться с ПЦР-тестом на COVID-19. Звезду «Полицейского с рублевки» Бурунова экстренно госпитализировали.
Капельная цифровая ПЦР (ddPCR)
| Что такое ПЦР | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году биохимиком Кэри Муллисом, работавшим в компании Cetus. |
| ПЦР тест: что это такое? — Блог MyGenetics | medium ПЦР (Полимеразная цепная реакция) Если попытаться описать ПЦР-диагностику в трёх словах, то это, совершенно определённо, будут слова ТОЧНО, НАДЁЖНО, БЫСТРО. |
| ПЦР в реальном времени | ПЦР расшифровывается как полимеразная цепная реакция. Данная реакция обеспечивает многократное воспроизводство определённых участков ДНК. |
Что такое ПЦР анализ
ОТ-ПЦР — это разновидность ПЦР, то есть полимеразной цепной реакции. Процесс самой ПЦР (полимеразной цепной реакции), как метод амплификаци нуклеиновых кислот in vitro рассмотрим отдельно (Прим. Как объясняют специалисты ФМБА, именно использование полимеразной цепной реакции при диагностике позволяет выявить РНК вируса кори за несколько дней до появления характерных клинических симптомов и обладает высокой аналитической чувствительностью. Полимеразная цепная реакция — это молекулярный метод, имитирующий процесс репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты для амплификации определенных сегментов ДНК in vitro. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году биохимиком Кэри Муллисом, работавшим в компании Cetus. ДНК-полимеразы.
ПЦР-тест — что это такое простыми словами, что показывает ПЦР анализ и когда назначается
Она позволяет обнаружить даже единственную частицу вируса в пробе и воспроизвести любой нужный участок ДНК в произвольном количестве. После первого опыта от Муллиса ушла любимая женщина. Едва он добился воспроизводимости результатов, как был уволен. Научные журналы отказались сообщать о ПЦР, потому что рецензенты не увидели в ней ничего нового. Принцип полимеразной цепной реакции Слева: упрощённая схема удвоения ограниченного праймерами фрагмента молекулы ДНК в процессе ПЦР, с диапазонами рабочих температур каждой стадии.
В среднем для достоверного ПЦР-анализа достаточно 40 циклов. Вырос он в Южной Каролине, сын коммивояжёра и домохозяйки. Когда родители развелись, мать пошла в риэлторы. Её контора быстро стала крупнейшей в столице штата, но дети оказались без присмотра.
Жалоб на них не поступало, у матери была только одна претензия: из кухни мешками пропадал сахар. Он должен был стать топливом для космического корабля. В 1959 году, 14 лет от роду, Кэри Муллис спроектировал ракету. Сплав сахара с калийной селитрой заливался в металлическую трубку длиной 120 см, зажигание производилось детонатором их тогда продавали детям без лишних вопросов.
Ракета взлетела вверх на целую милю. После сгорания твердотопливной части раскрылся парашют обитаемой кабины, и пассажир — обвалянный в асбесте лягушонок — вернулся из тропосферы живым. В студенческие годы Кэри устроил в курятнике лабораторию, где производил взрывчатку, которую вполне легальный дилер продавал горнякам. У Муллиса завелись деньги, он сменил пару жён.
На третьем курсе обнаружил ещё более интересный класс веществ. Каждую неделю студенты получали что-нибудь новое психоделическое и пробовали, обмениваясь впечатлениями — тогда это ещё было законно. Потребляя эти вещества в Беркли, аспирант Муллис проникся новыми космологическими теориями. Он подумал, что время для наблюдателя с Земли и для наблюдателя за пределами сферы, испускающей реликтовое излучение, должно течь в разные стороны.
И тут же накатал об этом псевдонаучную статью, нахально отослав её в Nature. Она вышла. Ко всеобщему изумлению, ведь Nature не печатала аспирантов. Научный руководитель Муллиса биохимик Джо Нейландс разрешал своим ребятам защищаться по любой теме, лишь бы они хоть что-нибудь делали.
Муллис решил после Беркли бросить химию и стать писателем. Его диссертация по космологии была выполнена в юмористическом жанре, так что половина комиссии была против присуждения учёной степени. Но статья в Nature перевесила. Защитившись, Муллис ушёл от второй жены к третьей.
Пока его романы ещё не были написаны, он работал менеджером ресторана, принадлежавшего его первой жене. Но беллетристика не пошла. Пришлось вернуться в химики. Новые рабочие места предоставляла только биохимия, которая сводилась к убийству крыс и выделению из их мозга какого-нибудь вещества.
Когда Кэри надоело рубить грызунам головы, он занялся синтезом ДНК в одной из первых биотехнологических корпораций «Ситэс». Его интересовали компьютеры. Кэри написал программу, собиравшую данные спектрофотометра, чтобы вовремя заканчивать синтез. Рабочий компьютер был связан по телефону с персоналкой «Амига» у Муллиса дома, так что он следил за реакцией удалённо — по меркам 1982 года фантастика.
Во-вторых, Муллис тут же закадрил свою самую красивую сотрудницу по имени Дженнифер Барнетт, и они стали жить вместе. Часто ссорились, иногда при всех в лаборатории.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов. Термостойкую ДНК-полимеразу чаще всего используется Taq-полимераза — полимераза, выделенная из Thermus aquaticus. Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов см.
Отжиг праймеров температура обычно в районе 50-60оС — к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца ренатурация , однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца по крайней мере, на начальных циклах ПЦР , поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления денатурации праймеров. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы. Также образуется малое количество более длинных молекул ДНК, которым можно пренебречь см. Рис 2. Затем реакция выходит на плато.
Это происходит из-за накопления продукта реакции, снижения концентрации праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов, а также за счет повышения концентрации пирофосфата см.
Далее мы повторяем эту процедуру. После каждого цикла получаем участок-мишень в двойном количестве. Спустя двадцать пять циклов ПЦР то есть менее чем через два часа имеем интересующий нас участок ДНК в количестве, в 225 раза превышающем исходное то есть мы амплифицировали его примерно в 34 миллиона раз. Фактически на входе у нас получалась смесь из праймеров, матричной ДНК, фермента ДНК-полимеразы и свободных оснований А, Ц, Г и Т, количество специфического продукта реакции ограниченного праймерами растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует. Поэтому нужно было заново добавлять ее перед каждым из 25 циклов. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента полимеразы, а материал это весьма недешевый. К счастью, на помощь пришла матушка-природа.
Это произошло потому, что данная температура является оптимальной для E. В природе встречаются микроорганизмы, чьи белки за миллионы лет естественного отбора стали более устойчивыми к действию высоких температур. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерии Thermus aquaticus, обитающей в горячих источниках Йеллоустонского национального парка, и названа Taq-полимеразой. ПЦР быстро превратилась в главную рабочую лошадку проекта «Геном человека». В общем, процесс не отличается от разработанного Муллисом, просто он был автоматизирован.
Мы больше не зависели от толпы подслеповатых аспирантов, кропотливо переливающих капельки жидкости в пластиковые пробирки. В современных лабораториях, осуществляющих молекулярно-генетические исследования, эта работа выполняется на роботизированных конвейерах.
У теста на антитела свои преимущества. Но я бы сказала так: они с ПЦР-тестом дополняют друг друга. Тест на антитела лучше работает на поздних стадиях. Антитела в крови сохраняются и тогда, когда вирус исчезает из организма, то есть с помощью такого теста можно узнать, кто переболел COVID-19 в прошлом. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в нее входит, он и разработал тесты, которыми пользуются в лабораториях Роспотребнадзора. То есть производит тесты «Вектор», а проводят тестирование региональные центры Роспотребнадзора. У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший.
Гамалеи , компания «ДНК-технология». И это хорошо, когда есть разные тест-системы, их можно сравнить, проверить результаты одной с помощью другой. На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе. Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить. Это много для наших масштабов или мало? Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать. В чем их принципиальные отличия?
Диагностика инфекций методом ПЦР: что это такое?
К счастью, на помощь пришла матушка-природа. Это произошло потому, что данная температура является оптимальной для E. В природе встречаются микроорганизмы, чьи белки за миллионы лет естественного отбора стали более устойчивыми к действию высоких температур. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерии Thermus aquaticus, обитающей в горячих источниках Йеллоустонского национального парка, и названа Taq-полимеразой. ПЦР быстро превратилась в главную рабочую лошадку проекта «Геном человека». В общем, процесс не отличается от разработанного Муллисом, просто он был автоматизирован. Мы больше не зависели от толпы подслеповатых аспирантов, кропотливо переливающих капельки жидкости в пластиковые пробирки.
В современных лабораториях, осуществляющих молекулярно-генетические исследования, эта работа выполняется на роботизированных конвейерах. ПЦР-роботы, занятые в столь масштабном проекте по секвенированию, как «Геном человека», неумолимо трудятся с огромными объемами термостойкой полимеразы. Некоторые ученые, работающие в проекте «Геном человека», были возмущены неоправданно высокими отчислениями, которые добавляет к стоимости расходных материалов владелец патента на ПЦР, европейский индустриально-фармацевтический гигант Hoffmann-LaRoche. Другим «движущим началом» стал сам метод секвенирования ДНК. Химическая основа этого метода в то время уже не была новинкой: Межгосударственный проект «Геном человека» HGP взял на вооружение тот же самый хитроумный метод, что еще в середине 1970-х годов разработал Фред Сенгер. Инновация же заключалась в масштабе и степени автоматизации, которых удалось достичь при секвенировании. Автоматическое секвенирование исходно разрабатывалось в лаборатории Ли Худа в Калифорнийском технологическом институте.
Исключение составляет биопсия желудка, которую проводят для определения наличия Helicobacter pylori — бактерии, вызывающей гастрит и язвенную болезнь.
Хранение и транспортировка биоматериалов Пробы подлежат отправке в амплификатор не позднее, чем через 2 часа после забора, если они находятся в помещении при комнатной температуре. После оттаивания они должны быть сразу использованы, повторное замораживание запрещено. В подавляющем большинстве случаев ПЦР-диагностика проводится «день в день»: пациент приходит в клинику, где у него берут мазок или кровь и сразу отправляют биоматериал в лабораторию, поэтому беспокоиться о правилах хранения не стоит. Как подготовиться к ПЦР-диагностике? Правила довольно просты: Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища спринцевания, свечи. Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию если таковая проводилась не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа; Кровь сдается из вены утром натощак; Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома. Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов — максимум 2 часа; Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой.
Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз. Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки. Результаты ПЦР-анализа Выше мы упоминали о качественной и количественной ПЦР-диагностике, так вот, в первом случае расшифровка результатов не представляет никакой трудности: ответ либо положительный, либо отрицательный. И если условия подготовки, сбора биоматериала, проведения анализа и оценки итогов не были нарушены, то нет и причин сомневаться в достоверности полученных данных. По-другому дело обстоит в случае с ПЦР количественной. Её результатом является число, демонстрирующее вирусную нагрузку. Чтобы понять, о какой цифре идёт речь, достаточно произвести умножение. Сколько стоит сдать ПЦР?
Для других материалов есть несложные правила — если их соблюдать, анализ будет точнее. Если вам назначили качественный ПЦР-анализ, имеет смысл сдавать его или в государственной лаборатории если обследование положено по ОМС , или в частной, где окажутся подходящие цены. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. Если указания на метод нет — выбирайте ту лабораторию, цены в которой вас устраивают. Новости о здоровье, интервью с врачами и инструкции для пациентов — в нашем телеграм-канале.
Подтверждение этому - Нобелевская премия в области химии, которой был удостоен К. Муллис в 1993 году. Помимо медицины метод нашёл применение в генетике, криминалистике, археологии. Универсальность метода позволяет применять его для диагностики большинства патологий вирусной, бактериальной, грибковой природы, а также вызываемых гельминтами и простейшими. Например, метод ПЦР активно используется для выявления таких болезней инфекционной природы, как ВИЧ, гепатиты всех видов, уреаплазмоз, хламидиоз, микоплазмоз, кандидоз, мононуклеоз, трихомониаз, герпетические инфекции, сальмонеллёз, туберкулёз и многие другие.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ДНК-полимеразы. По оценкам ResearchAndMarkets, в этом году глобальный рынок тестирования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая ПЦР в реальном времени, достигнет 9,9 млрд долларов. С 2015 года он рос со среднегодовым темпом в 28,11%, а пандемия еще больше уве. Превосходные свойства уплотнительного ободка позволяют проводить реакции ПЦР в объеме до 5 мкл. Суть полимеразной цепной реакции заключается в том, что берется малое количество материала для исследования, содержащего ДНК, а в процессе ПЦР происходит увеличение количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю и, таким. это метод, используемый для увеличения количества конкретной ДНК-последовательности из небольшого образца.
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
Итак, для начала, очень примечательно, что сам Кэри Муллис, изобретатель технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), говорил, что ПЦР не подходит для диагностики инфекции. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того. При такой диагностике ПЦР-тестов при любом вирусе мы получаем ложноположительный результат и везём пациента в стационар. Они провели исследование и смогли разработать ПЦР-тест, который может в несколько раз повысить точность диагностики. Новости рынка полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ноябрь 2022 г. Cepheid запустила Xpert Xpress MVP, мультиплексный ПЦР-тест, который выявляет ДНК организмов, связанных с тремя различными состояниями бактериальным вагинозом (БВ).
Чем отличается ПЦР от антител на КОВИД тест?
Кроме того, эта реакция позволяет сращивать фрагменты ДНК и вводить мутации. Избирательное копирование нужного фрагмента проводится в пробирке in vitro с помощью фермента , устойчивого к относительно высоким температурам. Этот фермент называется ДНК-полимеразой поэтому реакция полимеразная, а так как ДНК — это молекула-цепочка, то она также цепная. Суть действия этого фермента заключается в построении новой нити ДНК по шаблону комплементарной парной ей. Однако в отличие от копирования ДНК в живой клетке ПЦР, как уже было сказано выше, копирует многократно один и тот же участок. У клетки есть свой механизм решения этой проблемы, а для лабораторной ПЦР ученым нужно этот кусочек синтезировать.
Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения гибридизации матрицы с праймером отжиг , последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое.
Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.
Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Но статья в Nature перевесила.
Защитившись, Муллис ушёл от второй жены к третьей. Пока его романы ещё не были написаны, он работал менеджером ресторана, принадлежавшего его первой жене. Но беллетристика не пошла. Пришлось вернуться в химики. Новые рабочие места предоставляла только биохимия, которая сводилась к убийству крыс и выделению из их мозга какого-нибудь вещества. Когда Кэри надоело рубить грызунам головы, он занялся синтезом ДНК в одной из первых биотехнологических корпораций «Ситэс». Его интересовали компьютеры.
Кэри написал программу, собиравшую данные спектрофотометра, чтобы вовремя заканчивать синтез. Рабочий компьютер был связан по телефону с персоналкой «Амига» у Муллиса дома, так что он следил за реакцией удалённо — по меркам 1982 года фантастика. Во-вторых, Муллис тут же закадрил свою самую красивую сотрудницу по имени Дженнифер Барнетт, и они стали жить вместе. Часто ссорились, иногда при всех в лаборатории. Однажды девушка позвонила их общему начальнику и сказала, что Муллис едет на работу с пистолетом, чтобы пристрелить коллегу, на которого она слишком ласково посмотрела. Начальник примчался раньше и отправил потенциальную жертву во внеочередной отпуск. Но выгнать Муллиса было нельзя.
Его спасало, как ни странно, падение цен на нефть. В 1980 году, когда баррель стоил рекордные 36 долларов, нефтедобывающие корпорации вкладывали незапланированные сверхдоходы в новорожденную технологию рекомбинантной ДНК, где темпы развития опережали тогда общий рост фондового рынка. Под эти деньги Муллиса как раз и наняли. А через пару лет цена углеводородов на бирже пошла вниз, и нефтяники прекратили свои инвестиции. Чтобы собрать деньги на исследования, «Ситэс» выпустила акции и наняла президента-«варяга». Этот англичанин безжалостно подгонял учёных, которые в среднем проводили на работе по 70 часов в неделю. А Муллиса подгонять было не нужно, он и так работал все 80 часов.
Установил у себя первую машину для синтеза ДНК, и месячный план выполнял за день. Тогда президент для сокращения издержек велел ему уволить 4 сотрудников из 7. Дело было в пятницу вечером. Выходные Кэри с Дженнифер проводили на даче в 2,5 часах езды на автомобиле. По дороге Дженнифер заснула. Муллис выключил музыку и стал размышлять, как бы ему сохранить сотрудников. Нельзя ли помочь соседней лаборатории, пытавшейся заработать на абортах по медицинской страховке?
Если в ДНК плода обнаруживалась опечатка — мутация, вызывающая серповидноклеточную анемию — женщина имела право на прерывание беременности. Диагностика получалась дороговатой. ДНК выделяли, подсаживали в яйцеклетку мыши, а потом смотрели, не болен ли анемией клонированный мышонок. Нужны квалифицированные биохимики и три недели, за которые суррогатная мать-мышь производит на свет клон. Вот бы сделать прибор, куда лаборант помещает материал, нажимает кнопочку, и через пару дней всё готово. Муллис представил, как сделать клонирование без мыши, in vitro. При делении клетки спираль ДНК расплетается на две нити.
В клетке молекулу ДНК копирует фермент полимераза. Он давно выделен биохимиками, его заказывают по каталогу. После охлаждения смеси с денатурированной ДНК можно добавить в пробирку полимеразу и нуклеотиды, из которых фермент построит копию ДНК.
По словам его супруги, смерть наступила 7 августа.
Причина — сердечная и дыхательная недостаточность из-за пневмонии. О том, какой вклад он внес в биохимию и за что получил Нобелевскую премию, нам расскажет сам Джеймс Уотсон — первооткрыватель молекулы ДНК. История генетической революции Глава 7. Геном человека.
Открытие этой реакции было весьма примечательным. Позже Муллис вспоминал: «Однажды пятничным вечером в апреле 1983 года меня словно озарило. Я был за рулем, катил по залитой лунным светом извилистой горной дороге в Северную Калифорнию, край секвойных лесов». Впечатляет, что именно в такой ситуации его посетило вдохновение.
И дело совсем не в том, что на севере Калифорнии особенные дороги, способствующие озарению; просто его друг однажды видел, как Муллис безрассудно мчался по обледенелой дороге с двусторонним движением и это его совершенно не смущало. Друг рассказал New York Times следующее: «Муллису привиделось, что он погибнет, врезавшись в секвойю. Поэтому он ничего не боится за рулем, если вдоль дороги не растут секвойи». Наличие секвой вдоль дороги заставляло Муллиса сосредоточиться и… вот оно, озарение.
За свое изобретение в 1993 году Муллис получил Нобелевскую премию по химии и с тех пор стал еще более странным в своих поступках. Например он является сторонником ревизионистской теории о том, что СПИД не связан с ВИЧ, чем значительно подорвал собственную репутацию и помешал врачам. ПЦР — довольно простая реакция. Для ее проведения нам требуется два химически синтезированных праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Полимеразная цепная реакция
Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний наследственных, инфекционных. Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях in vitro. Метод ПЦР имеет очень высокую информативность и позволяет легко и эффективно определять наличие микобактерии в организме, но, только если проводить анализ мокроты если это туберкулез органов дыхания или мочи при туберкулезе орагнов мочевыделительной системы , а не крови. ПЦР анализ крови на туберкулез нельзя считать информативным, так как ДНК микобактерии туберкулеза в крови бывает только у больных туберкулезным сепсисом, что на практике встречается весьма редко.
На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.
Работа над мобильной платформой для диагностики велась с 2017 года в рамках одного из 30 проектов сотрудничества России и Японии. Клинические испытания проводились в Японии и России, при поддержке разработчиков «Вектора». Кроме того, испытания были проведены в Объединенных Арабских Эмиратах и Австрии. Чувствительность системы — от 5—10 копий вируса на реакцию, скорость — 18—20 минут.
В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения.
Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования. Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции.
Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа H1N1 в Японии. Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней.
Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился. Власти Москвы закупили 100 тыс.
В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи. Этапы проведения ПЦР исследования Забор биологического материала для исследования В качестве пробы служит различный биологический материал: кровь и ее компоненты, моча, слюна, отделяемое слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, отделяемое раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Все биопробы собираются одноразовыми инструментами, а набранный материал заключают в пластиковые стерильные пробирки или помещают на культуральные среды, с последующей транспортировкой в лабораторию. В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат — термоциклер амплификатор. В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов денатурация, отжиг и удлинение. Что это означает?
Рассмотрим подробнее. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра. II этап — Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки». Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР.
Метка, основанная на методе FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. При их близком расположении флюорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флюорофор-акцептор и испускает регистрируемый свет. Применение[ править править код ] ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях.
Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине для диагностики заболеваний и в сфере биотехнологий для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО. Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания. Количественная оценка экспрессии генов [ править править код ] кПЦР используется как один из способов количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определённого гена , например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды. Количественная оценка экспрессии генов с помощью традиционных методов обнаружения ДНК ненадёжна. Обнаружение мРНК с помощью нозерн-блота , или продуктов ПЦР на геле , или саузерн-блота не позволяет провести точное количественное определение. ПЦР в реальном времени может быть использована для количественной оценки нуклеиновых кислот двумя распространёнными методами: относительной количественной оценки и абсолютной количественной оценки [10]. Абсолютное количественное определение даёт точное количество целевых молекул ДНК с использованием калибровочной кривой. Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность амплификации. Относительная количественная оценка основана на внутренних эталонных генах генов домашнего хозяйства для определения кратных различий в экспрессии целевого гена.
Относительную количественную оценку легче выполнить, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество изучаемого гена сравнивается с количеством контрольного гена [11]. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК линкера к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, биология комплементарных линкеру [12]. ChIP-qPCR применяют для исследований конкретных генов и потенциальных регуляторных областей, таких как промоторы.