Основу процесса исследования составляет метод ПЦР в реальном времени, который зарекомендовал себя как очень быстрый и чувствительный способ, подчеркивают в Роспотребнадзоре. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом.
Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
| ПЦР анализ: когда нужно сдавать, как проводится исследование, методы диагностики заболеваний | Во-вторых, внедрение цифровизации ПЦР-диагностики увеличит пропускную способность лаборатории и поспособствует лавинообразному росту количества выполняемых анализов. |
| Актуальные методы диагностики COVID-19 | читайте в нашей статье. |
| Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности | Полимеразная цепная реакция или ПЦР — это метод создания множества копий определенного участка ДНК in vitro (в пробирке, а не в организме). |
| Диагностика COVID-19: обзор основных методов | ПЦР называют прямым методом, поскольку он выявляет возбудителя, а не иммунную реакцию организма, и является подтверждающим методом в диагностике инфекционных заболеваний. |
| Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности | В плане обнаружения ДНК наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). |
Что такое анализ ПЦР?
Другие виды исследования могут оказаться ложноотрицательными из-за того, что в образце недостаточно много вирусов или бактерий или организм не успел выработать достаточное количество антител. ПЦР-анализ проводится на образце одного из следующих видов биоматериала: кровь, слюна, слизь, ткань, гной, мокрота, моча. Этот процесс называется ПЦР с обратной транскрипцией. Обнаружение вирусной РНК с помощью ПЦР позволяет обеспечить диагностику COVID-19 на ранней стадии - до того, как организм выработает ответ в виде антител или даже до того, как у человека появятся симптомы заболевания. Тесты ПЦР играют решающую роль в предотвращении распространения заболеваний, так как часто позволяют выявить инфекции на ранней стадии, еще до появления симптомов. Количественный ПЦР-анализ позволяет оценить инфекционную нагрузку на организм, а также используется для анализа изменений экспрессии генов в опухолях.
Важна также и высокая скорость проведения исследования. В отличие от традиционного посева при выявлении бактериальных инфекций, который занимает несколько дней, ПЦР тест обычно выполняется в течение суток. Это значительно увеличивает вероятность назначения своевременного лечения. Кроме того, с помощью ПЦР можно определить латентных носителей инфекции. Необходимо строго соблюдать правила сбора биоматериала и его хранения.
Важно выбрать правильное время взятия биоматериала и выполнить правила подготовки к тесту.
ПЦР может генерировать достаточные для анализа мутаций количества специфических генов из образцов ДНК. Конкретные части генов обычно экзоны быстро амплифицируются с помощью специфичных праймеров. Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации. Анализ ДНК, генерируемой в ходе ПЦР, может быть выполнен менее чем за один день, существенно облегчая разработку и клиническое использование большого числа диагностических ДНК-тестов.
Сначала, с помощью того же фермента обратной транскриптазы, которую используют для изготовления библиотек клонов кДНК, на основе интересующей мРНК синтезируется однонитевая кДНК. Один из олигонуклеотидов запускает синтез второй нити кДНК, полученная двойная спираль затем служит в качестве объекта ПЦР. ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика.
После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле. Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру. Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля.
Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов. Справа - Установка для проведения электрофореза в геле.
Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков. Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них.
С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть. Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК.
Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис. Схема проведения Саузерн-блоттинга Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern — «северный». Денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE Выше мы рассмотрели основные принципы работы гель-электрофореза. Однако все чаще в литературе, посвященной исследованиям по секвенированию ДНК, можно встретить информацию об использовании метода ДГЭ или денатурирующего градиентного гель-электрфореза. В частности упоминается о т. Обнаружено, что определенные денатурирующие гели способны индуцировать расплавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие небольшие, как 200-700 пар оснований. Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным условиям денатурации, расплавленные нити полностью распадаются на отдельные нити.
Процесс денатурации на денатурирующем геле очень резкий большинство фрагментов плавятся в пошаговом процессе. Дискретные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий. Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательности фрагментов одинаковой длины часто приводят к тому, что они частично плавятся в разных положениях градиента и поэтому "останавливаются" в разных положениях геля. На чем основан метод DGGE? Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному.
Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления, т. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Клонирование ДНК Молекулярное клонирование - это совокупность экспериментальных методов в молекулярной биологии, которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организме хозяина. Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух различных организмов: вид, который является источником ДНК, подлежащей клонированию, и вид, который будет служить в качестве живого хозяина для репликации рекомбинантной ДНК. Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части а их сшивать с произвольными молекулами ДНК , разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома например, определенный ген.
В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину по сравнению со всей ДНК клетки. Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет такой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве. Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было упрощенно рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Клонирование определяется как процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий с использованием организмов здесь репликация. Основной подход предполагает использование бысто делящихся организмов чаще всего бактериальных клеток, обычно E. В нашем разделе о клонировании ДНК рассмотрим клонирование с использованием клеток бактерий E. Процесс самой ПЦР полимеразной цепной реакции , как метод амплификаци нуклеиновых кислот in vitro рассмотрим отдельно Прим.
Плазмида кодирует гены, регулирующие репликацию и контролирующие копийность 1—2 молекулы на клетку. Искусственные бактериальные хромосомы часто используются для секвенирования геномов организмов в различных проектах, например в проекте Геном человека. Короткий фрагмент ДНК исследуемого организма вставляется в хромосому, а затем амплифицируется и секвенируется. После этого прочитанные последовательности выравниваются in silico в результате чего получается полная последовательность генома организма. Сейчас такой подход был вытеснен более быстрыми и менее трудоёмкими методами секвенирования, например методом дробовика или методами секвенирования нового поколения. На рисунке - этапы BAC-клонирования фрагмента ДНК с использованием вектора плазмиды , содержащего ген lac Z изображены этапы до выделения плазмид с клонированным фрагментом рис. Этапы клонирования фрагмента ДНК с ипользованием кишечной палочки и вектора, содержащего ген lac Z все этапы см. Если вектор, содержащий такой ген, ввести в клетку E. Исходные мутантные клетки, не содержащие b-галактозидазу, не способны к этому превращению.
Следовательно, на среде с X-Gal исходные нерекомбинантные клетки будут давать белые колонии, а рекомбинантные клетки - голубые. Процесс клонирования ДНК включает следующие этапы: Получение целевых фрагментов ДНК в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции ; Выбор вектора Вектор - молекула ДНК или РНК, способная переносить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом хромосомой. Вставка фрагмента ДНК в вектор; Введение вектора в популяцию восприимчивых клеток хозяина и трансформация с помощью вектора организма хозяина то есть поглощение бактериальной клеткой молекулы ДНК из внешней среды ; Отбор успешно трансформированной клетки обычно отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости ; Размножение отобранной клетки Выделение векторных молекул из клетки Выделение целевого фрагмента ДНК. Изображение этапов клонирования Рис. Схема клонирования участка ДНК гена в бактериях Поскольку при каждом клеточном делении бактерии как и другие клетки удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК. Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в специальный вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду небольшую относительно бактериальной хромосомы - кольцевую молекулу ДНК, реплицирующуюся отдельно от хромосомы.
У бактерий «дикого типа» часто встречаются подобные структуры: они часто переносятся « горизонтально » между разными штаммами или даже видами бактерий. Чаще всего в них содержатся гены устойчивости к антибиотикам именно из-за этого свойства их и открыли или бактериофагам, а также гены, позволяющие клетке использовать более разнообразный субстрат. Иногда же они «эгоистичны» и не несут никаких функций Именно такие плазмиды обычно и используют в молекулярно-генетических исследованиях. В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации последовательность, с которой начинается репликация молекулы , целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой обычно, это гены устойчивости к какому-нибудь антибиотику. Плазмидная карта может быть прочитана путем понимания ее особенностей, таких как название и размер плазмиды, тип элементов в плазмиде и их относительное положение, а также ориентация промотора. В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент ДНК, после чего добавляют ее в культуру бактерий при специальных условиях, обеспечивающих трансформацию — процесс активного захвата бактерией ДНК из внешней среды риc. После этого проводят отбор бактерий, трансформация которых прошла успешно, добавляя соответствующий гену в плазмиде антибиотик: в живых остаются только клетки, несущие ген устойчивости а, следовательно, и плазмиду. Далее, после роста культуры клеток, из нее выделяют плазмиды, а из них с помощью рестриктаз выделяют «наш» фрагмент ДНК или используют плазмиду целиком. Если же ген вставили в плазмиду для того, чтобы получить его белковый продукт, необходимо обеспечить культуре условия для роста, а потом просто выделить требуемый белок.
На этом месте сразу же должен возникать вопрос: как же все это возможно было использовать до того, как были расшифрованы геномы, да и чтение последовательности ДНК было еще дорогим и малораспространенным? Положим, с помощью рестрикции и клонирования полученных фрагментов мы получим библиотеку ДНК, то есть набор бактерий, несущих различные плазмиды, содержащие суммарно весь геном или заметную его часть. Но каким образом мы сможем понять, в каком из фрагментов содержится необходимый ген? Для этого использовали метод гибридизации.
Образцы берут либо с помощью амниоцентеза либо с помощью биопсии ворсин хориона. В отличие от многих других тестов, ПЦР тест способен обнаружить признаки заболевания на самых ранних стадиях инфицирования, так как для выделения искомого ДНК или РНК достаточно минимального количества генетического материала патогена в образце биоматериала.
Другие виды исследования могут оказаться ложноотрицательными из-за того, что в образце недостаточно много вирусов или бактерий или организм не успел выработать достаточное количество антител. ПЦР-анализ проводится на образце одного из следующих видов биоматериала: кровь, слюна, слизь, ткань, гной, мокрота, моча. Этот процесс называется ПЦР с обратной транскрипцией. Обнаружение вирусной РНК с помощью ПЦР позволяет обеспечить диагностику COVID-19 на ранней стадии - до того, как организм выработает ответ в виде антител или даже до того, как у человека появятся симптомы заболевания. Тесты ПЦР играют решающую роль в предотвращении распространения заболеваний, так как часто позволяют выявить инфекции на ранней стадии, еще до появления симптомов. Количественный ПЦР-анализ позволяет оценить инфекционную нагрузку на организм, а также используется для анализа изменений экспрессии генов в опухолях.
Важна также и высокая скорость проведения исследования. В отличие от традиционного посева при выявлении бактериальных инфекций, который занимает несколько дней, ПЦР тест обычно выполняется в течение суток. Это значительно увеличивает вероятность назначения своевременного лечения. Кроме того, с помощью ПЦР можно определить латентных носителей инфекции.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
| Что такое анализ ПЦР? - статья лаборатории ДНКОМ | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. |
| Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры | Нельзя ПЦР или ИФА-диагностикой заменить все существующие методы исследования. |
| Что такое анализ ПЦР? | Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа. |
| Метод ПЦР диагностики: сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции | Диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) показывает наличие половых инфекций с очень большой точностью. |
| Достоверность метода ПЦР | Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция, позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя. |
Все под контролем! Правильный способ использования внутреннего контрольного образца (ВКО)
Анализ методом ПЦР – это диагностический метод, позволяющий выявить наличие возбудителя заболевания в организме даже, если он присутствует в минимальных количествах. Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных результатов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяйствах. В качестве материала для исследований методом полимеразной цепной реакции выступают кровь, моча, слюна, мокрота, ликвор, биоптаты тканей, соскобы со слизистых оболочек.
ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится?
Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Асимметричная ПЦР англ. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Групп-специфическая ПЦР англ. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Какие биологические материалы исследуются? Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб. Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный одноразовый флакон.
Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек.
Все, что нужно для проведения анализа — небольшое количество любого биоматериала пациента. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена. Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека.
Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена возбудителя опасных заболеваний , хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров — отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» — многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя. Преимущества метода ПЦР Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Исключен риск ложноположительных результатов. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена или даже уже неактивных — разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве , чтобы он был обнаружен в ходе исследования. Скорость проведения.
Данный метод способен выявить возбудителя даже на стадии инкубационного периода, однако он не дает представления об активности вируса, как это дает ИФА. Кроме того, ПЦР может не выявить генитальный герпес и цитомегаловирус в соскобе с влагалища, если вирус находится в "спячке" - для выявления данных инфекций рекомендуется использовать метод иммуноферментного анализа. Правила сдачи материала на ПЦР-диагностику такие же, как при бакпосеве. ПЦР - наиболее точный и современный метод диагностики.
Серологические и иммунохимические исследования ПИФ предусматривает прямое выявление антигенов хламидий. ПИФ-метод является важнейшим скриниговым методом диагностики урогенитального хламидиоза. Показания к назначению анализа:.
Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний. Полимеразная цепная реакция ПЦР — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты ДНК в биологическом материале пробе. В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях in vitro. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Кроме простого увеличения числа копий ДНК этот процесс называется амплификацией , ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК , и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний наследственных, инфекционных , для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов. Специфичность и применение ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически.
Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем ИППП. Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций , таких как гепатиты , ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими это сделать невозможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды вода, почва и т.
Диагностика COVID-19: обзор основных методов
Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет. Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). В качестве материала для исследований методом полимеразной цепной реакции выступают кровь, моча, слюна, мокрота, ликвор, биоптаты тканей, соскобы со слизистых оболочек. К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — это точный метод лабораторной диагностики, который используют для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. это метод диагностики, широко применяемый в современной медицине. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) или ОТ-ПЦР в диагностике текущей инфекции. Диагноз COVID-19 устанавливается путем выявления РНК SARS-CoV-2 при помощи МАНК или ОТ-ПЦР. По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. При самолечении и самостоятельной сдаче анализов для исследования методом ПЦР в сетевой лаборатории высок риск того, что вы будете годами лечиться от несуществующей болезни.
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
Иногда перечень, наоборот, сокращается до «ПЦР 4» гонорея-трихомониаз-хламидиоз-микоплазмоз. ПЦР качественная и ПЦР количественная У этих двух видов ПЦР-диагностики принципиально разные цели: качественный анализ даёт ответ на вопрос, имеется ли вообще у пациента искомый микроб, то есть просто «да» или «нет». Только что рассмотренный комплекс ПЦР 12 относится как раз к этой категории. Но существует ещё количественный анализ, или ПЦР в режиме реального времени. Метод основывается на том, что число новых ампликонов копий заданного участка ДНК возбудителя болезни прямо пропорционально их исходному количеству. То есть если в пробе с самого начала было много вредоносных молекул ДНК, то с каждым циклом полимеразной цепной реакции их будет становиться вдвое больше, а к концу процесса накопятся миллионы. Современные приборы амплификаторы следят за тем, как меняется количество копий, и по итогам исследования вычисляют примерную концентрацию возбудителя в организме пациента. Для чего это нужно? В случае с бактериями, простейшими или грибками подобные сведения имеют спорную диагностическую ценность, поскольку численность колоний постоянно меняется под воздействием самых разных факторов, да и уничтожить такие микроорганизмы сравнительно просто.
Другое дело — вирус. Это неклеточная форма жизни, которую невозможно истребить подобно тому, как антибиотики справляются с бактериями. В борьбе с вирусами человек может твёрдо рассчитывать только на свой иммунитет, а возможности противовирусных средств сильно ограничены. Именно когда дело касается вирусов, становится особенно актуальной методика ПЦР в режиме реального времени. Вирусная нагрузка или виремия — это степень тяжести поражения организма вирусом. Показатель рассчитывается путём определения числа вирионов в биологическом материале, измеряется в МЕ или в количестве копий на 1 мл крови и служит для контроля над ходом терапии и предупреждения распространения вируса. Но и в случае с другими вирусами определение нагрузки может оказаться полезным — например, когда речь идёт о цитомегаловирусе, герпесе или папилломовирусе. Анализ поможет понять, грозит ли человеку очередное обострение болезни, и насколько высока вероятность передачи инфекции.
Достаточно чистая и хорошо смачиваемая гидрофильная пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится. В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели ПААГ и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов.
Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует. А Электрофорез в полиакриламидном геле Рис. Электрофорез в полиакриламидном геле чаще используется для белков Электрофорез в полиакриламидном геле ПААГ или PAGE - метод, широко используемый для разделения биологических макромолекул в соответствии с их электрофоретической подвижностью.
Подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Как и во всех формах гель-электрофореза, молекулы могут работать в своем естественном состоянии, сохраняя структуру молекул более высокого порядка, или может быть добавлен химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную линейную цепь, подвижность которой зависит только от ее длины и отношение массы к заряду. Таким образом, разделяют т. Базовые приготовления Образцы могут представлять собой любой материал, содержащий белки. Они могут быть получены биологически, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, проб окружающей среды или очищенных белков. Образец для анализа необязательно смешивают с химическим денатурантом, обычно SDS для белков. SDS - это анионный детергент, который денатурирует вторичные и недисульфидно-связанные третичные структуры и дополнительно придает отрицательный заряд каждому белку пропорционально его массе. Приготовление акриламидных гелей Гели обычно состоят из акриламида, бисакриламида, необязательного денатурирующего вещества SDS и буфера с отрегулированным pH. Раствор можно дегазировать под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации.
Источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED, добавляются для инициирования полимеризации. Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида, который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами полиакриламида. Гели, как правило, полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в гелеобразователе, с гребнем, вставленным вверху для создания лунок для образца. После того, как гель полимеризован, «расческа» может быть удалена, и гель готов для электрофореза. Электрофорез В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными. Электрическое поле воздействует на гель, заставляя отрицательно заряженные белки мигрировать через гель от отрицательного электрода катода к положительному электроду аноду. В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: маленькие молекулы легче проникают через поры в геле, в то время как более крупные имеют большую сложность. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; Миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях.
По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы движутся дальше вниз по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Следовательно, биомолекулы могут быть разделены примерно в соответствии с размером, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле. Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру. Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля.
Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов. Справа - Установка для проведения электрофореза в геле.
Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков. Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них.
С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть. Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК.
Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис. Схема проведения Саузерн-блоттинга Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern — «северный». Денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE Выше мы рассмотрели основные принципы работы гель-электрофореза. Однако все чаще в литературе, посвященной исследованиям по секвенированию ДНК, можно встретить информацию об использовании метода ДГЭ или денатурирующего градиентного гель-электрфореза. В частности упоминается о т. Обнаружено, что определенные денатурирующие гели способны индуцировать расплавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие небольшие, как 200-700 пар оснований. Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным условиям денатурации, расплавленные нити полностью распадаются на отдельные нити.
Процесс денатурации на денатурирующем геле очень резкий большинство фрагментов плавятся в пошаговом процессе. Дискретные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий. Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательности фрагментов одинаковой длины часто приводят к тому, что они частично плавятся в разных положениях градиента и поэтому "останавливаются" в разных положениях геля. На чем основан метод DGGE? Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному.
Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления, т. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Клонирование ДНК Молекулярное клонирование - это совокупность экспериментальных методов в молекулярной биологии, которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организме хозяина. Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух различных организмов: вид, который является источником ДНК, подлежащей клонированию, и вид, который будет служить в качестве живого хозяина для репликации рекомбинантной ДНК. Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части а их сшивать с произвольными молекулами ДНК , разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома например, определенный ген.
В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину по сравнению со всей ДНК клетки.
Значительный объем данных, получаемых при выполнении секвенирования генома, обуславливает продолжительность выполнения NGS-секвенирования генома. Например, изучение панели наиболее распространенных генов, мутации в которых имеют клиническую значимость в онкологии примерно 30 генов , методом NGS выполняется в срок 20-30 рабочих дней.
Технологические возможности секвенаторов, работающих в лаборатории МИБС, позволяют говорить о резерве снижения срока выполнения тестирования по мере роста спроса на профессиональную генетическую диагностику со стороны российских онкологов из других регионов. С конца 2021 года МИБС предлагает удобную схему логистики образцов тканей опухолей и образцов крови для выполнения NGS-исследований, что открывает доступ к высокотехнологичной диагностике онкологу из любого региона, тем самым повышая качество лечения онкологических заболеваний на уровне государства. Для выбора наиболее оптимальной схемы лечения с включением в ее состав иммунотерапии либо таргетной терапии, клинические онкологи лечебных центров, входящих в структуру МИБС Онкологическая клиника МИБС, Центр протонной терапии МИБС используют данные NGS, полученные в собственной молекулярно-генетической лаборатории ПЦР полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция - это хорошо знакомый, точный и востребованный метод определения мутаций в указанных генах.
С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. В таком случае невысокая стоимость и небольшой срок выполнения исследования, являющиеся преимуществом ПЦР при решении точечных диагностических задач при необходимости всестороннего изучения генов у онкологических пациентов не перекрывают определенных ограничений, которые присущи ПЦР. В первую очередь, это недостаточная информативность - один ПЦР-анализ позволяет проверить мутацию в одном конкретном гене, которую может предположить врач-онколог.
В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами: ПЦР исследование - позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов к.
Гордиев М. Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога. Секвенирование по Сэнгеру С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики.
Диагностика методом ПЦР на сегодняшний день является самым эффективным способом обнаружения и идентификации возбудителей половых инфекций в человеческом организме. В этой статье мы разберем, что такое анализ ПЦР, как и где сдать этот тест. Вы узнаете, какова цена этого исследования, где выполняют ПЦР анализы и как готовится, когда требуется сдать ПЦР анализ. Вы узнаете о методиках забора мазков, какой врач берет анализы на ПЦР и почему медсестра плохо берет мазки на ПЦР анализ. Разберем ПЦР анализ: что это такое и как выполняют это исследование. ПЦР анализ: что это такое? ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей. В них происходит анализ на предмет присутствия возбудителей инфекционных, паразитарных или вирусных заболеваний. Суть ПЦР состоит в многократном «клонировании» находящихся в исследуемом материале фрагментов ДНК инфекционного агента.
ПЦР диагностика инфекций считается наиболее быстрым, современным методом. ПЦР диагностику используют повсеместно. Все ведущие клиники используют диагностику ПЦР для верификации инфекционных заболеваний.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций: Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться; В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений; Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней; За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек; Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти; За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур сауны, бани и т. Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах. Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве. Ведь в нашем организме присутствуют условно-патогенные микробы, которые становятся причинами заболеваний только в результате активного роста и размножения. Основываясь на количественных данных анализа ПЦР, врач может выяснить стадию развития патологического процесса, его активность, подобрать специфическое лекарственное средство и его дозировку.
Как уже было сказано, с помощью методики можно установить отцовство. Используется отдельная модификация анализа.
Подготовка к исследованию Меры зависят от того, какой биоматериал будут брать. Вот некоторые варианты: Моча Изучение урины требуется, когда проводят диагностику мочеполовых инфекций, поражений венерического плана у мужчин и женщин. У первых методика применяется не всегда. Часто ее заменяют забором соскоба из уретры. Перед проведением обследования, накануне запрещена гигиена репродуктивных органов. Анализ сдают в течение суток с момента подозрительного полового акта. Но это не строгое требование, а скорее рекомендация по раннему выявлению патологического процесса.
Кровь Также ее отдельные компоненты: сыворотка и пр. Забирают для определения гепатитов разных форм, дифференциальной диагностики патологий печени, выявления герпеса, СПИДа, также при обследовании на предмет генетических аномалий. Особых правил подготовки в этом случае нет. Кровь сдают натощак, это единственное требование к пациенту. Мокрота Отделяемое слизистой оболочки дыхательных путей. Исследуется для диагностики респираторных патологий, пневмонии, бронхита, определения источника процесса. Также в рамках выявления других поражений: будь то легочные формы микоплазмоза или прочие.
Специальная подготовка не требуется. Биоптат Биологический материал слизистой оболочки пищевода и желудка. Используется для диагностики причин язвы, гастрита и прочих патологий этой области. Например, таким способом удается надежно обнаружить хеликобактер, который чаще всего и оказывается виновником патологических процессов. Подготовки опять же не нужно. Соскобы со слизистых оболочек Используются особенно часто. В основном, в рамках выявления венерических заболеваний, коронавируса.
Но не только. Достаточно временно ограничить гигиену половых органов или полости рта, чтобы не смыть следы патогенной флоры, вирусов. Другие биологические жидкости Будь то ликвор, секрет предстательной железы и прочие. По показаниям. Подготовка будет специфической. Вопрос стоит уточнить у лечащего врача. Основном требование подготовки к анализу ПЦР и его проведению — это забор биоматериала в стерильную посуду.
Кроме того, образец не должен контактировать с окружающей средой и руками медицинского персонала. Как показывает практика, больше половины случаев неверного результата обусловлена именно нарушениями технологии получения биоматериала. Потому для ПЦР-анализа используются одноразовые колбы, пробирки, вакуумные системы забора крови, которые обеспечивают полную стерильность условий обследования. В случае, если у врача есть подозрения на неточность анализа, диагностика проводится еще раз. Полимеразная цепная реакция Методы проведения теста Существует как минимум десяток способов ПЦР, но многие из них не относятся к медицине и используются в научных целях.
На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. Инвертированная ПЦР [en] inverse PCR — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов лигирование. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берётся в большом избытке. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов [18]. В этом методе используют флуоресцентно меченые ДНК-зонды для анализа накопления продукта реакции или интеркалирующий краситель SYBR Green или его аналоги. Sybr Green I [en] обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров.
Как правило, конечная концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 0,2 мМ. Буфер — смесь катионов и анионов используемая в определенной концентрации, обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
Значение рН буфера колеблется от 8,0 до 9,5 и стабилизируется Трис-HCl. Одним из компонентов буфера Taq-полимеразы является ион калия KCl , который способствует отжигу праймеров. Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы. Анализируемый образец — вносимый в реакционную смесь препарат, обычно содержащий искомую ДНК, служащую мишенью для амплификации. В случае отсутствия ДНК-мишени продукт не образуется. Иногда для удобства детекции или контроля эффективности в состав реакционной смеси могут быть внесены дополнительные компоненты. Внутренние контроли — несвойственный данному организму фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Практически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке. ДНК-зонды — искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера около 30 нуклеотидов , комплементарные специфическим ампликонам продуктам реакции.
Могут использоваться для детекции продуктов ПЦР, благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам. Эти компоненты способны понижать температуру денатурации матрицы или стабилизируют ДНК-полимеразу. Если в пробе имеется искомая ДНК, с ней происходит ряд последовательных цикличных реакций, которые различаются температурными режимами. Ход реакции Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1]. Денатурация — процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур. Отжиг — процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются. Элонгация синтез. Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы.
Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются: ПЦР с «горячим» стартом hot-start PCR — суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров. ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа. ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» End-point PCR — эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени.
Достоверность метода ПЦР
| Актуальные методы диагностики COVID-19 | Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека. |
| История открытия современных методов молекулярной диагностики | Специфическое обследование на SARS-CoV-2 делают двумя способами: методом ПЦР и посредством экспресс-тестирования. |
| Принципы ПЦР-диагностики | ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами. |
| Что такое анализ ПЦР? - статья лаборатории ДНКОМ | 40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост. |
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе). Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты. ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей.
Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
Исследуемый биоматериал Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала[9]. Выбор зависит от типа инфекции. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы. Для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты. Для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.
Подготовка к исследованию Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала[10]. Кровь сдается натощак утром. Мочу также следует собрать утром в стерильный контейнер и сдать в лабораторию в ближайшие два часа. Перед взятием мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания.
Как только копий становится много, сразу начинается считывание». Применение ПЦР ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими. Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности. Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его. Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом. Какие биологические материалы исследуются В исследовании обычно используются различные биоматериалы: — Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса. Их забирают методом биопсии.
Предварительно нужно почистить зубы и прополоскать рот, нельзя есть до взятия биоматериала. Важно собирать не слюну или носоглоточную слизь, а мокроту. Сделайте несколько глубоких вдохов, чтобы вызвать «мокрый» кашель. Необходимо откашлять содержимое глубоких дыхательных путей. Сплюньте мокроту в заранее подготовленный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Минимальный объём мокроты — 1 мл. Доставьте контейнер в лабораторное отделение в день взятия биоматериала. Подготовка к соскобу из зева За 24 часа до исследования по предварительному согласованию с лечащим врачом следует отказаться от терапии полости рта какими-либо лекарственными препаратами. Подготовка к соскобу из влагалища или урогенитального тракта За 30 дней до исследования следует прекратить применение антибиотиков по согласованию с лечащим врачом. За 24 часа до исследования не следует проводить спринцевание, внутривагинальную терапию свечи, тампоны , не использовать антисептические средства в том числе мирамистин , исключить половой контакт. В день исследования запрещается проводить туалет половых органов. Женщинам рекомендуется сдавать анализ до менструации или через 5 дней после её окончания. Мужчинам рекомендуется не мочиться в течение 3 часов 15—20 минут в случае обильных уретральных выделений до взятия материала.
У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший. Гамалеи , компания «ДНК-технология». И это хорошо, когда есть разные тест-системы, их можно сравнить, проверить результаты одной с помощью другой. На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе. Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить. Это много для наших масштабов или мало? Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать. В чем их принципиальные отличия? Почему государство выбрало именно те, что сделали в «Векторе»? Если эта РНК исчезнет в процессе, не даст сигнала, значит, что-то пошло не так. Это знак, что могла исчезнуть и вирусная РНК, а стало быть, отрицательный результат следует считать ложноотрицательным. Про остальные тест-системы поговорим, когда они получат регистрационные удостоверения. Почему государство выбрало именно «Вектор» для выполнения этого задания, мне неизвестно. Может быть, в этом причина, может быть, в чем-то другом, это надо узнавать у тех, кто принимал решение.