При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных результатов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяйствах.
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. диагностика) считается одним из самых современных и точных методов молекулярной диагностики различных инфекций, в том числе урологических и гинекологических заболеваний.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Прежде всего, это высокая чувствительность, т. Во-вторых, тест также высокоспецифичный точный , то есть сводит к минимуму риск ложноположительных результатов правильно определяет здоровых людей. Еще одно преимущество метода - скорость и повторяемость. Стоит помнить, что возможность тестирования с помощью этого метода сейчас широко доступна. Сделать тест на коронавирус вы можете в нашей лаборатории. Мы также предлагаем сдать анализы крови, мочи и кала для правильной диагностики различных заболеваний.
Все прошло отлично. Анатолий Ц. Обращался в клинику с деликатным вопросом! Всё быстро, чётко, по адекватной цене! Доктор Никитин, великолепный специалист!
Олег Журба Я благодарен своему врачу Волохову Е. По сути я в клинике и не лечился в итоге, а за то, что не смотря на свою специальность, он не зациклился на инфекциях и помог мне найти причину своих страданий. Я 4 года думал, что боль, которая мучила меня связана с простатитом и инфекциями. Я прошел около 10 курсов различного лечения антибиотиками, всякими массажами простаты, и ведь лечили меня все урологи, уверенные, что дело именно в этом. И к нему я приехал именно искать ИППП. А оказалась грыжа диска позвонка. Блин, неужели никому в голову не могло прийти проверить это за 4 года? В итоге невролог, электрофорез, остеопат сделали свое дело. Вот такие дела. А лучшей рекомендацией для клиники и врача с моей стороны стал даже не этот отзыв, а уже 3 моих знакомых, ставших посетителями этого мед центра.
Себестоимость ПЦР-анализа неуклонно снижается, что способствует все более широкому использованию метода в лечебных и диагностических учреждениях. Количество ПЦР-лабораторий в странах СНГ растет в геометрической прогрессии и, видимо, в ближайшее время ПЦР-анализ станет одним из самых распространенных методов лабораторной диагностики. Суть метода заключается в многократном копировании амплификации в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ. Эта реакция носит название репликации ДНК. Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, то есть осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. Создание программируемых термостатов амплификаторов , которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для их идентификации.
Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки 20 нуклеотидных пар , называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Амплификация специфических фрагментов ДНК;. Детекция продуктов амплификации. Выделение ДНК РНК На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Амплификация специфических фрагментов ДНК На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации.
Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Ее пять штрих-концов фиксируются ферментом ДНК-полимеразой, что обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплиментарной первой. То же самое, только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, однако, поскольку расплетение молекулы ДНК идет в обратном порядке, новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются. Для того чтобы фермент ДНК-полимераза начал свою работу, требуется наличие затравки или праймера - небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который, соединяясь с комплиментарным участком одной из цепей родительской ДНК, образует стартовый блок для наращивания дочерней нити. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная температура отжига праймеров - одна из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплиментарным последовательностям. Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера. Фактически праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован.
Такие фрагменты ДНК называются ампликонами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого. Время отжига -20-60 сек. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой олигонуклеотиды длиной около 20 п. Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дезоксирибонуклеотидфосфат. Этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой.
Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК ампликона и т. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, точнее, природой его клеточной стенки. Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная В. Она включает ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК, однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ. Одним из наиболее популярных является метод выделения ДНК, предложенный R. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера.
Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого числа стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами и образующимся аэрозолем ДНК. При классической процедуре фенольно-хлороформной экстракции ДНК достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex США , которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, мешающие реакции.
Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание». Применение ПЦР ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими. Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности. Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его. Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом. Какие биологические материалы исследуются В исследовании обычно используются различные биоматериалы: — Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса.
Чем отличается диагностика ПЦР от ИФА
Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР — результат окажется положительным. Другой вариант — это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин — материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория. Когда следует бежать в лабораторию, чтобы проанализировать итоги вашего летнего отпуска?
Специалисты советуют делать это в следующих случаях: выделения, зуд, чувство жжения в области половых органов, резко изменившийся запах от половых органов, дискомфорт при мочеиспускании, необычный характер выделений цвет, количество, консистенция , случайный половой контакт без применения презерватива. Чаще всего его используют для диагностики именно заболеваний, передающихся половым путем. В этих случая обычно материалом для исследования является мазок. Например, мазок на хламидии у женщин берут из влагалища, у мужчин — из уретры. Для анализа биоматериалом могут быть и слюна, и кровь, и моча, и выделения половых органов.
В любом случае нельзя ограничиваться только одним методом. Лучше всего комбинировать различные методы исследования — помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА. И помните: положительный ответ любого, даже самого современного лабораторного исследования — это повод не для паники, а для визита к врачу. Источники Ravichandran S. VB10, a new blood biomarker for differential diagnosis and recovery monitoring of acute viral and bacterial infections.
Например, если делают анализ на хламидии, то праймер соответствует специфическому участку гена, кодирующего главный белок наружной мембраны МОМР Chlamydia trachomatis. Итак, вторая стадия - присоединение праймеров к ДНК также называется отжигом длится от 20 до 60 секунд. Температура отжига равна 50 - 65 градусам для каждого вида возбудителей, то есть для каждого праймера, она своя. На этом этапе мы уже разделили ДНК на две половинки и не даём им соединиться. Теперь самое время достроить каждую половинку до полноценной ДНК.
Но температура, при которой это должно произойти, очень высока, по меркам молекулярной биологии — более 70 градусов выше температуры отжига. Проблема была решена благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этого фермента заключается в его исключительной термостойкости период полужизни при 95 градусах составляет 40 минут и высокой рабочей температуре — оптимум работы 72градуса. В клетках, фермент ДНК-полимеразы отвечает за копирование и "ремонт" ДНК и способен удлинять короткие нуклеотидные цепочки праймеров, последовательно присоединяя к одному из концов праймера дополнительные нуклеотиды, таким образом, достраивая цепь до конца. Так ДНК копирует саму себя.
Третий этап - достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от конца к концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор "кирпичики" - все те же производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой Taq-полимеразой и проходит при температуре 70 - 72 градуса. Время протекания синтеза зависит от длины достраиваемого фрагмента и обычно принимается равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.
Теперь мы имеем две двойные цепочки ДНК вместо одной, исходной. Ну а дальше процесс повторяется. Опять температура повышается до 93 - 95 градусов, цепочки разъединяются... Обычно за 1 - 2 часа при наличии вирусной ДНК ее становится столько, что не заметить ее, даже при стандартном методе обнаружения становится просто нереально. Схематично, это выглядит так: Подведём итог: каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий.
В первую стадию денатурация происходит так называемое раскручивание ДНК — то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую отжиг - происходит присоединение праймера к участку нити ДНК. И, наконец, в заключительной третьей стадии, "фермент-строитель" достраивает нити, восстанавливая ДНК. В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения амплификаций определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами.
Как проводится ПЦР-анализ С 1983 года, когда был изобретен данный метод, прошло много времени, и технологии не стоят на месте. Сегодня существует несколько различных методик для проведения ПЦР-теста: С обратной транскрипцией. Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке. Вложенная ПЦР или «гнездовая» — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров. Изотермические методы — не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны. Инвертированная ПЦР — применяется, если имеется только короткий фрагмент известной последовательности, но необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. ПЦР в реальном времени — метод, позволяющий определить не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество ее копий после каждого цикла амплификации, что дает возможность для проведения тестов с количественным результатом Это далеко не все существующие на сегодняшний день разновидности ПЦР-технологий. Ученые активно развивают эту важную и перспективную область лабораторной диагностики, совершенствуют методы ПЦР, оттачивают техники и изобретают новые подходы. Иногда возможно проведение экстренного теста — его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов. Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена его количество в одном миллилитре пробы. Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем. Перезвоните мне.
Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать. Второе — чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры — кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый — по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера. Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования". Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи. Лаборатория научно-исследовательского института скорой помощи имени Н.
Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
| Актуальные методы диагностики COVID-19 | Диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) показывает наличие половых инфекций с очень большой точностью. |
| Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | Флуоресцентные методы детектирования продуктов ПЦР расширяют возможности применения. |
Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
Rebrikov D. Knowledge Laboratory, 2009. Традиционные методы лабораторной диагностики инфекций базируются на таких классических методах микробиологии, как микроскопия, культуральное исследование, а также на серологической диагностике — радиоиммунном, иммуноферментном, иммунофлюоресцентном анализе, реакции прямой и непрямой гемагглютинации, реакции преципитации и связывания комплемента. Но у этих методов есть свои недостатки — большая длительность и трудоемкость проведения анализа, необходимость специальной подготовки персонала, а также достаточно высокая стоимость. Молекулярная биология на современном этапе располагает широким спектром новейших методик, направленных на возможность выявления антигенов, ферментов, токсинов и нуклеиновых кислот возбудителя ДНК И РНК. Ведущую роль среди них занимают методы исследований, направленные на обнаружение генетического материала возбудителей инфекций. Использование наночастиц позволяет определить присутствие инфекционных агентов в малом объеме пробы напрямую, а также дает возможность проведения современной мультиплексной диагностики в максимально сжатый срок. На сегодняшний день генодиагностика занимает одно из ведущих мест среди других методов клинической лабораторной диагностики. Оптимальным для проведения рутинных анализов считается полимеразная цепная реакция ПЦР , которая представляет собой осуществляемую в условиях in vitro специфическую амплификацию накопление нуклеиновых кислот с использованием синтетических праймеров.
Методика исследования материала с использованием принципа полимеразной цепной реакции была разработана американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 г. Перед ним стояла задача создания метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с добавлением фермента ДНК-полимеразы. Спустя несколько лет после обнародования своего открытия, в 1993 г. Изначально метод диагностики был запатентован компанией «Цетус Корпорейшн», в которой и работал его создатель. Но в 1992 г. В России метод полимеразной цепной реакции был внедрен и начал использоваться в 1995 г. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике инфекционных заболеваний.
Это возможно при низкой вирусной нагрузке слишком малое количество вируса в верхних дыхательных путях , поздних стадиях заболевания, когда у пациента уже поражены лёгкие вирус «спустился» из носоглотки в лёгкие , и при неправильном взятии мазка. Такое бывает, когда мазок берут со слизистой носовых ходов и ротовой полости, а не из носоглотки и ротоглотки.
Эспресс-тесты проводятся для обнаружения антигенов коронавируса — белковых частиц, которые входят в состав вируса и распознаются иммунной системой. Экспресс-тесты на COVID-19 достаточно просты в использовании, а их проведение не требует специальной лаборатории и больших временных затрат результат бывает готов через 15-30 минут. Специальных навыков для проведения экспресс-тестирования также не требуется.
Касаткина, За тел. Новгород, ул. Невзоровым д. Также менее строгие требования предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Применяя специфические олигонуклеотидные праймеры, варианты метода теперь используют не только в молекулярной биологии и биотехнологии, но и в медицине например, для идентификации микроба или вируса по его ДНК, для контроля излечения пациента от инфекционного заболевания, идентификации типа мутации в геномной ДНК при анализе наследственных заболеваний.
Находит применение эта реакция и в криминалистике для идентификации личности по ДНК-содержащим жидкостям и тканям модификацию исходного метода криминалисты назвали в стиле своей профессии - «геномная дактилоскопия». Используется она и для установления отцовства, степени родства, популяци-онных исследований - словом, везде, где нужно установить для той или иной цели уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала: капельку крови, мочи, соскоб с ткани, отдельный волос. В настоящее время ПЦР является одним из наиболее важных диагности- ческих инструментов исследования нуклеиновых кислот с целью постановки диагноза социально значимых заболеваний, таких как: туберкулез код по МКБ-10 А15 - А19 ; инфекции, передающиеся преимущественно половым путем T. А50 - А64 ; гепатит В В16; В18.
Этот метод позволяет осуществлять только качественный анализ и имеет ряд ограничений и недостатков: большие затраты времени на стадию детекции; невозможность автоматизации; сложность и субъективность трактовки результатов; высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение; повышенные требования к организации лаборатории; максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР; выделение отдельного сотрудника на стадию детекции; постоянный контроль смывов. Преимуществом данного подхода является возможность совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации. Москва, ул. Касаткина, За тел. Новгород, ул.
Невзоровым д. Также менее строгие требования предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Применяя специфические олигонуклеотидные праймеры, варианты метода теперь используют не только в молекулярной биологии и биотехнологии, но и в медицине например, для идентификации микроба или вируса по его ДНК, для контроля излечения пациента от инфекционного заболевания, идентификации типа мутации в геномной ДНК при анализе наследственных заболеваний. Находит применение эта реакция и в криминалистике для идентификации личности по ДНК-содержащим жидкостям и тканям модификацию исходного метода криминалисты назвали в стиле своей профессии - «геномная дактилоскопия».
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
ПЦР диагностику используют повсеместно. Все ведущие клиники используют диагностику ПЦР для верификации инфекционных заболеваний. Часто пациенты спрашивают, какие именно заболевания можно выявить при помощи метода ПЦР диагностики? Диагностика методом ПЦР используется для выявления широкого спектра возбудителей. Как делают ПЦР анализ? Такое исследование проводится одинаково для диагностики любого заболевания. Разница может быть лишь в исследуемом субстрате. Для этого пробирку с биоматериалом помещают в реактор, где с помощью катализаторов происходит процесс копирования молекул ДНК возбудителя инфекции. Метод ПЦР очень быстрый и простой.
В качестве результата, вы получаете заключение врача лаборанта. В результате четко будет прописано: получен положительный результат или отрицательный. Ответ приходит на конкретную инфекцию.
К сожалению, на данном этапе такое невозможно, и приходится довольствоваться результатами того секвенирования, которое есть. Каждая кДНК из такой библиотеки представляет собой фрагмент ДНК разного размера, фланкированный по обоим краям специальными адаптерами. Наличие адаптеров необходимо для последующей амплификации образцов и секвенирования. Методы создания библиотек кДНК варьируются в зависимости от конечной цели исследования и типа изучаемой РНК РНК может различаться в размере, последовательности, структурных особенностях а также в концентрации. Перед созданием бибилиотеки кДНК, подходящей для конкретного эксперимента, необходимо ответить на следующие вопросы: 1 какие именно молекулы РНК представляют интерес; 2 как получить кДНК желаемого размера; 3 каким способом лучше присоединенить адаптерные последовательности к краям кДНК для амплификации и секвенирования. Непосредственно перед проведением ПЦР можно ввести молекулярные маркеры.
Эта процедура особенно актуальна, если РНК в образце изначально немного, как, например, в случае секвенирования РНК одной клетки. Метод секвенирования РНК становится основным методом определения того, какие гены и на каком уровне экспрессируются в клетке. С помощью РНК секвенирования можно определять различия в экспрессии генов на различных стадиях развития организма или в разных тканях. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах , а потом читается каждый участок по отдельности. Клонирование происходит либо просто выращиванием клеток в чашке Петри, либо в случаях, когда это было бы слишком медленно или по каким-то причинам не получилось бы при помощи так называемой полимеразной цепной реакции. В кратком и неточном изложении работает она примерно так: сначала ДНК денатурируют, то есть разрушают водородные связи, получая отдельные нити. На следующем этапе полимераза копирует ДНК, после чего процесс можно повторять: после новой денатурации отдельных нитей будет уже вдвое больше, на третьем цикле — вчетверо, и так далее. Все эти эффекты достигаются в основном с помощью изменений температуры смеси из ДНК, праймеров и полимеразы; для наших целей важно, что это достаточно точный процесс, и ошибки в нём редки, а на выходе получается большое число копий участков одной и той же ДНК. Разные методы секвенирования отличаются друг от друга не методами клонирования, а тем, как потом прочесть получившийся «суп» из многочисленных копий одной и той же ДНК...
Примечание редактора Если имеется желание ознакомиться с темой секвенирования более детально, а не в обзорном порядке, то в данном разделе предусмотрен т. Выделение ДНК и РНК Выделение нуклеиновых кислот Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР, секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта. Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. В данной статье рассматриваются самые распространенные, а также прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот. Итак, выделение ДНК и РНК - важный шаг подготовки проб для выполнения различных задач в микробиологии, биотехнологии, биохимии, медицинской диагностике и т. Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. На сегодняшний день имеется множество специализированных методик, которые могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот с высокой степенью очистки.
Наиболее известные из них относятся к методикам осаждения НК на суспензионный носитель и выделения НК на колонках. Однако набирают популярность и другие методы, о которых будет сказано позднее. Видео: Выделение ДНК. Просо о сложном. В зависимости от того, из какого организма выделяют НК используют различные методы разрушения клеток: Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий — ЭДТА, лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или гуанидинизотиоцианат. Разрушение клеток животных и человека не вызывает сложностей: используют гомогенизацию, обработку SDS додецилсульфатом натрия , либо клетки обрабатывают протеиназами. Для разрушения клеточных стенок растений — ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. Отделение нуклеиновых кислот от белков Депротеинизацию клеточного лизата часто осуществляют с помощью фенола и хлороформа белки переходят в фазу растворителя.
Молекулярщики часто подразумевают смесь водонасыщенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование. Часто белки разрушают протеиназами, например, протеиназой К; центрифугированием для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Ряд современных методов предусматривает осаждение ДНК на гранулах силикагеля, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые коммерческие наборы предусматривают сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Когда нуклеиновые кислоты остаются в водном растворе: ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе. Концентрацию полученной нуклеиновой кислоты, а также наличие примесей белки обычно определяют спектрофотометрически по поглощению на А260 нм. Максимум поглощения белка приходится на 280 нм. Для оценки чистоты препарата ДНК, свободного от РНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, то есть на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов, соответственно.
Пять популярных методик выделения нуклеиновых кислот Выделение фенол-хлороформом Рис. Схема протокола выделения фенол-хлороформным методом. Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот. Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической нижней фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной верхней фазе Рис. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.
Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени. Выделение на спин-колонках Рис. Схема протокола выделения на спин-колонках. Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё Рис. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца. Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом.
Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено. Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты. Выделение на магнитных частицах Рис. Схема протокола выделения на магнитных частицах. Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 3. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др. К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу.
После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют Рис. Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование например, центрифуга. Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца. Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие. Умное выделение Smart Extraction Рис. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena.
Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry. Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества Рис. Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот. Ферментативное температурно-зависимое выделение Рис. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM.
Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку. Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами. Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов. Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот.
Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения от 7 минут и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов. Разрезание и сшивание ДНК Рестрикция и рестриктазы Разрезание ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах. Этот метод был изобретен при изучении в 1950—1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой.
Эта стадия длится 7—10 минут. Количество специфического продукта реакции ограниченного праймерами теоретически возрастает пропорционально 2n — 2n, где n — число циклов реакции [15]. Число «длинных» копий ДНК тоже растёт, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов , образованием побочных продуктов.
На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. Инвертированная ПЦР [en] inverse PCR — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов лигирование. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа.
Классические микробиологические методы посевы и культивирование на культурах клеток не обладают необходимой скоростью диагностики и не удовлетворяют потребности Роспотребнадзора при расследовании случаев групповой заболеваемости, но являются единственными видами исследований, при которых можно выделить и накопить «чистую культуру» возбудителя для дальнейшего использования в научно-практической деятельности. Метод полимеразной цепной реакции предусматривает работу с любым генетическим материалом без подразделения по микробиологическим направлениям, что дает возможность организации централизованной ПЦР-лаборатории как отдельного структурного подразделения по различным направлениям деятельности. Первые исследования проводились с элетрофоретической детекцией продуктов амплификации. Но полноценно в практику лабораторной диагностики метод ПЦР в нашем центре был внедрен с приобретением амплификаторов, с детекцией в режиме реального времени, с 2003г.
Что такое ПЦР анализ
Как проводится ПЦР-диагностика, когда назначают исследование с помощью этого метода и как подготовиться к анализу. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. Что такое ПЦР, как работает метод ПЦР в диагностике, преимущества методики, показания, подготовка к проведению ПЦР-анализа, как проводится ПЦР-анализ, что показывают результата теста. Этот метод используется во всем мире при разработке тест-систем на основе ОТ-ПЦР, в том числе для диагностики РНК-содержащих вирусов, к коим относится и новый коронавирус SARS-CoV-2.
История открытия современных методов молекулярной диагностики
Специфическое обследование на SARS-CoV-2 делают двумя способами: методом ПЦР и посредством экспресс-тестирования. Во-вторых, внедрение цифровизации ПЦР-диагностики увеличит пропускную способность лаборатории и поспособствует лавинообразному росту количества выполняемых анализов. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА. ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. Анализ методом ПЦР – это диагностический метод, позволяющий выявить наличие возбудителя заболевания в организме даже, если он присутствует в минимальных количествах.
Микробиологические исследования
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе). Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — это точный метод лабораторной диагностики, который используют для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. • При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Они в чем-то схожи, поскольку выполняют одну задачу — поиск причины патологических состояний, обусловленных проникновением в организм человека инфекционных агентов. Однако между ними есть и различия. Методам ПЦР доступны нуклеиновые кислоты «врага», находящиеся во всех биологических жидкостях и тканях организма, поэтому данный анализ не обязывает использовать в качестве исследования только венозную кровь, можно взять слюну, выделения из половых путей, мокроту или другую среду, несущую информацию о заболевании. Выбор материала для исследования остается за врачом, который предполагает ту или иную патологию и знает, какая среда в таких случаях более информативна. В чем суть полимеразной цепной реакции? ПЦР-исследование — это достижение и огромная заслуга молекулярной биологии. Это — метод, который, обнаружив микроучастки ДНК или РНК чужеродного генетического материала генома , способен распознать индивидуальные характеристики, присущие только одному виду микроорганизмов, не спутав его ни с каким другим. Как же работает метод ПЦР и как ему удается восстановить картину поведения инфекционной клетки в живом организме? Однако для дальнейшего процесса необходимо большое количество таких микроучастков, что может обеспечить его размножение путем достраивания новых, идентичных найденному фрагменту, участков ДНК репликация. Размножение является естественным и неотъемлемым свойством нуклеиновой кислоты, которая будет реплицироваться с помощью фермента полимеразы даже вне живого организма в пробирке с пробой , образуя множество клонов, то есть, пойдет цепная реакция.
Клонироваться будут все новые и новые фрагменты, но только те, в которых заинтересован исследователь. Вот почему так важно взять «чистый», без посторонних примесей анализ, а тест проводить очень аккуратно.
Сразу после взятия плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек. При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгиваний и расплескиваний, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей. При переносе клинического материала из пробирок, флаконов в новые использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами.
Строго соблюдать правила хранения и транспортирования клинических проб. Охлаждающие элементы перед транспортированием клинического материала замораживать до необходимой температуры. Для проведения пробоподготовки используют ПЦР-боксы. Чтобы смешать необходимые для исследований реагенты используют центрифуги и вортексы. Чтобы извлечь реакционную смесь и прочие материалы применяют автоматические дозаторы.
Помещения иоборудование лаборатории ПЦР. Рабочие зоны представляют собой боксированные помещения, состоящие из бокса и предбокса, соответствующим образом промаркированы. В рабочей зоне 1 осуществляют прием материала, его маркировку, регистрацию в специальном журнале, первичную подготовку. В рабочей зоне 2 проводят выделение и очистку нуклеиновых кислот микроорганизмов из проб, подготовленных в рабочей зоне 1. В рабочей зоне 3 осуществляют приготовление реакционных смесей, проведение обратной транскрипции.
В рабочей зоне 4 проводят амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации. Результаты ПЦР анализа на инфекции обычно выглядят как таблица. В первой колонке идут виды возбудителей, определенных в ходе анализа. Во второй результаты. Таким образом, технология ПЦР обеспечивает возможность изучения и диагностики хронических инфекционных процессов, экологии возбудителей инфекционных заболеваний и открывает новые перспективы в медицинской диагностике.
Литература: Патрушев Л.
Иногда перечень, наоборот, сокращается до «ПЦР 4» гонорея-трихомониаз-хламидиоз-микоплазмоз. ПЦР качественная и ПЦР количественная У этих двух видов ПЦР-диагностики принципиально разные цели: качественный анализ даёт ответ на вопрос, имеется ли вообще у пациента искомый микроб, то есть просто «да» или «нет».
Только что рассмотренный комплекс ПЦР 12 относится как раз к этой категории. Но существует ещё количественный анализ, или ПЦР в режиме реального времени. Метод основывается на том, что число новых ампликонов копий заданного участка ДНК возбудителя болезни прямо пропорционально их исходному количеству.
То есть если в пробе с самого начала было много вредоносных молекул ДНК, то с каждым циклом полимеразной цепной реакции их будет становиться вдвое больше, а к концу процесса накопятся миллионы. Современные приборы амплификаторы следят за тем, как меняется количество копий, и по итогам исследования вычисляют примерную концентрацию возбудителя в организме пациента. Для чего это нужно?
В случае с бактериями, простейшими или грибками подобные сведения имеют спорную диагностическую ценность, поскольку численность колоний постоянно меняется под воздействием самых разных факторов, да и уничтожить такие микроорганизмы сравнительно просто. Другое дело — вирус. Это неклеточная форма жизни, которую невозможно истребить подобно тому, как антибиотики справляются с бактериями.
В борьбе с вирусами человек может твёрдо рассчитывать только на свой иммунитет, а возможности противовирусных средств сильно ограничены. Именно когда дело касается вирусов, становится особенно актуальной методика ПЦР в режиме реального времени. Вирусная нагрузка или виремия — это степень тяжести поражения организма вирусом.
Показатель рассчитывается путём определения числа вирионов в биологическом материале, измеряется в МЕ или в количестве копий на 1 мл крови и служит для контроля над ходом терапии и предупреждения распространения вируса. Но и в случае с другими вирусами определение нагрузки может оказаться полезным — например, когда речь идёт о цитомегаловирусе, герпесе или папилломовирусе. Анализ поможет понять, грозит ли человеку очередное обострение болезни, и насколько высока вероятность передачи инфекции.
Должно наступить хорошее окрашивание частей клеток и бактерий в разные цвета, чтобы оценить состав выделений из уретры, влагалища и шейки матки. Анализ соскоба из уретры или влагалища в гинекологии позволяет определить: - количество лейкоцитов их повышение говорит об инфекции, но у здоровых женщин небольшое число лейкоцитов присутствует во флоре ; - количество эритроцитов основной показатель воспалительного процесса при повышенном количестве ; -состав флоры у женщин он зависит от менструального цикла, но активность клеток говорит о нарушении микрофлоры ; - наличие трихомонады, гонококков, грибка — основная цель для выявления возбудителя инфекций; - наличие лактобацилл их отсутствие говорит о нарушенной микрофлоре. Также мазок определяет степень чистоты влагалища женщины: 1 и 2 степень — характерна для здоровой флоры, а 3 и 4 — выявляет кольпит, воспаление. Преимущества данного метода состоят в простоте, доступности и быстроте получения результатов 30 - 60 мин и менее.
Однако чувствительность данного метода ограничена около 105 бактерий в 1 мл. Практически не определяются в урогенитальном мазке вирусы, хламидии, микоплазмы и уреаплазмы, и одних только результатов мазка часто бывает недостаточно для постановки диагноза. Результаты мазка обычно можно использовать как ориентировочные. Перед сдачей мазка лучше воздержаться от мочеиспускания.
ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится?
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе). Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА. ПЦР анализ на инфекции Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии.